甾類同化激素類藥物殘留分析技術——前處理方法（四）

時間：2023-03-25 04:18:43來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

甾類同化激素類藥物殘留分析技術——前處理方法（四）

[db:作者] / 2022-12-13 00:00

(4)衍生化方法

由于ASs的沸點高不易揮發，通過化學衍生可以增加樣品的揮發度或提高檢測靈敏度，從而利于氣相色譜(GC)檢測，在ASs的殘留檢測中通常采用硅烷化和酰化等衍生法。而HPLC的化學衍生法則是在一定條件下利用化學衍生試劑或標記試劑與樣品組分進行化學反應，產物有利于檢測或分析。衍生化方法主要有：硅烷化法、酰化法、酯化法、鹵化法、環化法。

1)硅烷化衍生

硅烷化是ASs最普遍的衍生化方式，常用的硅烷化試劑有：三甲基硅烷(TMS)、雙(三甲基硅烷基)氟乙酰胺(BSTFA)、N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺(MSTFA)和N，O-雙(三甲硅基)乙酰胺(BSA)等。ASs結構中凡含活潑氫原子基團均可發生硅烷化反應，如羥基、酚羥基、可烯醇化的酮基、氨基、羧基、硫酸等，生成TMS醚、TMS烯醇醚、TMS胺或TMS酯衍生物。一般還需加入催化劑以提高對位阻基團的硅烷化能力。常用的催化劑包括疊氮基三甲基硅烷、N-三甲基咪唑(TMSim)、三甲基氯硅烷(TMCS)、三甲基碘硅烷(TMIS)和乙酸鉀。除乙酸鉀外，大部分催化劑自身也是硅烷化試劑。TMCS和TMIS可產生鹵酸，反應液中需加入酸受體物質，如吡啶等。目前，ASs殘留檢測主要采用MSTFA進行硅烷化衍生。

Marchand等采用GC-MS檢測肉中的超痕量ASs。SPE洗脫液旋轉蒸干后，通過液液分配將ASs分為兩類：含D4-3-酮類和酚結構類。D4-3-酮類具體衍生條件：加入MSTFA-TMIS-DTT(1000+5+5，v/v/w)60℃孵育40min；酚結構類具體衍生條件：MSTFA-I2(1000+4，v/v)，室溫反應，再用GC-MS測定。該方法測得23種ASs的LOD為5～100ng/kg。

Impens等建立了檢測腎脂肪和肉中雌激素、孕激素和雄激素殘留的GC-MS/MS方法。SPE洗脫液氮氣吹干后，采用MSTFA進行衍生。將樣品轉移至自動進樣小瓶內，氮氣吹干，加入25μL mSTFA渦動混勻，進行衍生后，用氣相色譜-離子阱-多級質譜法(GC-IT-MSn)檢測。該方法測得雌激素、孕激素和雄激素的CCa為0.5～5ug/kg，CCβ為0.5～2.5ug/kg。

Yamada等報道了采用GC-MS/MS同時檢測馬尿中多種蛋白同化類固醇主要代謝物的方法。尿液經β-葡萄糖醛酸酶水解后，用Sep-Pak C18 PlusSPE柱凈化，洗脫液氮氣吹干后，加入疊氮基三甲基硅烷，80℃衍生化反應30min后，用GC-MS/MS在MRM模式下檢測。方法LOD為5～50ng/mL，平均回收率為71.3%～104.8%，CV為1.1%～9.5%。

Kootstra等建立了尿液中ASs多殘留檢測的GC-MS方法。該方法采用TMS進行衍生，主要用于定性和半定量分析低劑量的ASs。衍生化條件為：加入30μL TMS，60℃孵育1h，衍生化產物氮氣吹干(60℃)，加入異辛烷超聲溶解后，GC-MS檢測。該方法在添加濃度為1μg/L時，測得ASs的CCa為0.06～0.77μg/L，CCβ為0.09～0.46μg/L；添加濃度為2μg/L時，測得ASs的CCa為0.26～0.54μg/L，CCβ為0.44～0.92μg/L，準確度為92.6%～122.2%。

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?；彩禽^為常用的衍生化方法，主要針對ASs的羥基、可烯醇化的酮基和氨基。衍生化試劑可分為三類：酰氯、全氟代酸酐和含有活性?；幕衔?如酰基咪唑)。常用的?；噭┯衅叻∷狒?HFBA)、五氟苯甲酰氯、N-甲基-雙-三氟代乙酰胺和三甲基乙酸酐等。?；苌镆子谥苽洌话銓⒋郎y物溶于吡啶或四氫呋喃，加入過量的酰化劑即可。

曾東平等建立了豬肌肉中甲基睪酮、炔諾酮、17a-乙炔雌二醇、雌二醇、6a-甲基-17a-羥基孕酮、苯甲酸雌二醇和醋酸氯地孕酮等8種性激素殘留的GC-MS檢測方法。豬肌肉樣品經過乙醚提取，氨基SPE柱凈化，濃縮后，加入50μL hFBA-丙酮(1+4，v/v)，于60℃靜置衍生反應1h，再加入700μL甲苯和500μL雙蒸水，混勻離心后取上層供GC-MS檢測。在2.5～50μg/kg濃度范圍保持良好線性，相關系數大于0.97；在2.5μg/kg、10μg/kg、50μg/kg添加水平下，8種性激素的回收率為67.7%～148%；方法LOD為0.94～2.41μg/kg，LOQ為3.13～8.03μg/kg。李青等采用乙醚和石油醚提取畜禽肉及內臟中的雌二醇，在凈化、吹干的試樣殘渣中加入1mL衍生劑HFBA，超聲20min，氮氣吹干，再加入0.5mL異辛烷，混勻后GC-電子捕獲檢測器(ECD)檢測。方法LOD為0.5μg/kg，回收率為84.0%～93.0%。

我國國家標準GB/T22967-2008、GB/T20749-2006分別檢測牛奶、奶粉中β-雌二醇殘留量和牛尿中β-雌二醇殘留量。樣品經過β-葡糖苷酸酶和芳基硫酸苷酶水解和HLBSPE柱凈化后，洗脫液氮氣吹干后，用五氟苯甲酰氯于60℃衍生化15min，再用GC-MS測定，內標法定量。牛奶和牛尿的LOD均為0.25μg/kg，奶粉的LOD為2μg/kg，牛奶中回收率為84.1%～95.3%。

3)羥胺衍生化

羥胺衍生化又稱為肟化。肟是含有羰基的醛、酮類化合物與羥胺類物質作用生成的一類化合物。羥胺衍生化是根據甾體類激素的酮基可提供進行親核加成部位的性質，以羥胺類物質為衍生化試劑，將甾體類激素的酮基在一定條件下與羥胺類物質進行親核加成反應，生成肟類物質。常見的試劑如鹽酸羥胺、0-甲基羥胺、0-苯基羥胺、0-丁基羥胺、0-五氟芐基羥胺，生成肟或烷基肟，也常作為保護ASs酮基的方法。

Regal等建立了牛血清中雌激素的LC-MS/MS檢測方法。血清樣品經乙腈提取和正己烷除脂，氮氣吹干，然后用1.5mol/L羥胺溶液(pH10)進行羥胺衍生化，90℃反應30min，衍生化產物用叔丁基甲醚提取，濃縮后復溶于甲醇-水中，最后用LC-MS/MS分析。方法CCa為6.00～19.46ng/L，CCβ為11.84～33.02ng/L。

4) 其他衍生方法

Athanasiadou等對增強ESI電離的化學衍生化方法進行了綜述，具有很好的參考意義。以19-去甲雄酮為例，分別列舉了其羰基(圖8-4)、羥基(圖8-5)可發生的化學衍生化方法及衍生化產物。

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