β-內(nèi)酰胺類藥物的殘留檢測(cè)（一）

時(shí)間：2023-03-25 06:56:57來源：food欄目：食品快速檢測(cè) 閱讀：

β-內(nèi)酰胺類藥物的殘留檢測(cè)（一）

[db:作者] / 2022-12-09 00:00

5.1.4.2測(cè)定

β-內(nèi)酰胺類藥物的殘留檢測(cè)方法已有大量報(bào)道，主要有微生物檢測(cè)法、免疫檢測(cè)法、色譜法以及色質(zhì)聯(lián)用法，而色譜法主要包括液相色譜法(LC)、氣相色譜法(GC)和薄層色譜法(TLC)等。免疫檢測(cè)法的優(yōu)點(diǎn)在于費(fèi)用相對(duì)較低，便于使用，方便攜帶，適合現(xiàn)場(chǎng)開展工作，具有高選擇性和靈敏度，具有很大的發(fā)展前景；而微生物法和理化檢測(cè)法則較為成熟。20世紀(jì)90年代以后，在β-內(nèi)酰胺類藥物殘留分析方法中LC法占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，并隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，色質(zhì)聯(lián)用儀器的逐步普及，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)以其選擇性好、靈敏度高、分析速度快、不需衍生化、可同時(shí)定性定量等優(yōu)點(diǎn)成為目前β-內(nèi)酰胺類藥物殘留分析中最主要的手段。

(1)微生物法

微生物法是建立在抗生素能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)原理的基礎(chǔ)上，能簡(jiǎn)單快速地測(cè)定所有抗生素殘留的一種篩選檢測(cè)技術(shù)。這些傳統(tǒng)檢測(cè)方法的主要優(yōu)點(diǎn)是廉價(jià)，易于操作和適于大量樣品的篩選，但所需時(shí)間長(zhǎng)，顯色狀態(tài)需通過肉眼判斷，易產(chǎn)生誤差。同時(shí)，由于具備抑菌作用的抗生素種類繁多，而動(dòng)物源食品中干擾物質(zhì)又多，結(jié)果造成假陽性率較高，方法缺乏特異性。Stead等對(duì)微生物法測(cè)定牛奶中10種抗生素(包括6種β-內(nèi)酰胺類藥物)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。取100μL牛奶至瓊脂平板，經(jīng)塑料膜密封后放置水浴鍋中孵育(64℃)3h，Delvo檢測(cè)試劑盒判定檢測(cè)終點(diǎn)。當(dāng)添加水平在歐盟規(guī)定的殘留限量水平時(shí)，檢出陽性結(jié)果的正確率為100%。Wachira等使用低成本的微生物方法測(cè)定雞組織中的青霉素G。采用蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌瓊脂擴(kuò)散，在pH7的條件下，在測(cè)試板上測(cè)定肝臟和腎臟樣品中青霉素G的濃度均低于MRL(50ng/g)，且2倍的LOD也低于MRL，可有效地用于青霉素G的常規(guī)篩查。Ang等對(duì)微生物法和LC法測(cè)定牛奶中阿莫西林和氨芐青霉素進(jìn)行了對(duì)比。微生物法操作如下：將樣品加至平板孔內(nèi)，每份樣品4個(gè)平板，對(duì)照樣品單獨(dú)加樣。然后將平板置64℃孵育3h，孵育后測(cè)定抑菌圈。將10ng/mL設(shè)定為曲線的校準(zhǔn)點(diǎn)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，校準(zhǔn)平均值獲得藥物濃度。結(jié)果表明兩種方法測(cè)定結(jié)果一致，但LC法比微生物法靈敏度高。

(2)薄層色譜法(thin layer chromatography，TLC)

TLC在獸藥殘留的快速篩選檢測(cè)方面應(yīng)用廣泛，特別是高效薄層色譜法(HPTLC)的斑點(diǎn)原位掃描定量、定性和高效分離材料彌補(bǔ)了常規(guī)TLC在靈敏度和重復(fù)性方面的不足，還保持了TLC的簡(jiǎn)便、快速和樣品容量大的優(yōu)點(diǎn)，可使用正相或反相，分辨率幾乎與HPLC相當(dāng)。動(dòng)物組織中殘留的氨芐西林、芐青霉素和苯甲氧基青霉素有采用TLC分析的報(bào)道，固定相主要是硅膠或纖維素。除個(gè)別學(xué)者使用自動(dòng)射線照相色譜檢測(cè)閃爍計(jì)數(shù)器定量外，其他的TLC方法多使用生物抑制法進(jìn)行檢測(cè)和定量。這種技術(shù)的缺點(diǎn)是操作復(fù)雜、時(shí)間長(zhǎng)、重現(xiàn)性較差，而且炅敏度低，LOD通常為50μg/kg。Grzelak等建立了一種檢測(cè)牛奶中頭孢乙腈、頭孢呋辛的TLC分析方法。該方法采用的TLC板為Si 60 F254(10cm×20cm)，分離獲得的條帶在254nm波長(zhǎng)處進(jìn)行檢測(cè)。TLC平板用正己烷除去牛奶樣品中的脂肪，再用甲醇-甲苯-乙酸乙酯-98%甲酸(5+20+65+10，v/v)作為展開劑，結(jié)果顯示頭孢乙腈回收率為97.66%，頭孢呋辛為86.13%。盧英強(qiáng)等建立了一種快速鑒定動(dòng)物皮膚或肌肉組織中青霉素的TLC方法，將組織勻漿，經(jīng)0.2moL/L H2SO4酸化，用3倍體積的乙酸乙酯浸泡24h，分離提純后，置75℃水浴中濃縮。TLC展開系統(tǒng)：氯仿-苯-冰乙酸(2+2+1，v/v)，展開后，室溫條件下自然干燥15min，取出層析板，計(jì)算Rf值和觀察色斑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從動(dòng)物組織中分離提純青霉素獲得的色斑與青霉素標(biāo)準(zhǔn)品色斑和Rf值完全相同，層析色譜清晰。

(3)毛細(xì)管電泳法(capillary electrophoresis，CE)

CE具有高柱效、分析時(shí)間短、樣品范圍寬等特點(diǎn)。但由于電滲流的不穩(wěn)定，CE的重現(xiàn)性較差，且進(jìn)樣量太小，造成檢測(cè)靈敏度較低。目前，CE已發(fā)展出多種不同的分離模式，如毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CAE)、膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜(MEKC)、毛細(xì)管等電聚焦(CIEF)、毛細(xì)管凝膠電泳(CGE)和毛細(xì)管等速電泳(CITP)等，使其在抗生素分析中得到快速發(fā)展。陳號(hào)采用HPCE方法來評(píng)價(jià)青霉素GIAC柱的柱效。采用涂層石英毛細(xì)管柱(50um×60cm)，分離電壓18kV，二極管陣列檢測(cè)器(DAD)檢測(cè)波長(zhǎng)198nm，溫度25℃，緩沖液為30mmoL/L硼砂緩沖液(pH3.8)。HPCE檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線在1～100ug/mL范圍內(nèi)線性良好，青霉素G樣品添加回收率為76.38%～94.67%，CV為5.67%～15.91%。朱丹成用CAE測(cè)定氨芐青霉素的含量，緩沖液為25mmoL/L硼砂緩沖液(pH7.98)，在4min內(nèi)出峰，電壓以16kV為佳，測(cè)定LOD為4mg/L，加樣回收率為97.9%～102.4%，RSD小于3%。Santos等采用50.5cm熔融石英CAE，以25mmoL/L磷酸緩沖液(pH6.8)為電泳緩沖液，20min內(nèi)檢測(cè)了牛奶中的14種常用CEPs，LOD在0.42～0.16μg/mL之間。姚曄等采用MEKC法分離檢測(cè)5種β-內(nèi)酰胺類抗生素。緩沖液為20mmoL/L Na2HPO4-20mmoL/L NaH2PO4(pH8.5)，20mmoL/L十二烷基硫酸鈉和體積分?jǐn)?shù)25%甲醇，在18kV電壓下5種抗生素在15min內(nèi)達(dá)到基線分離。各組分線性關(guān)系良好，LOD為5.3～8.1mg/L，進(jìn)樣精密度RSD為3.8%～5.5%。該研究表明，對(duì)分子結(jié)構(gòu)特別相近的抗生素，通過表面活性劑膠束固定相與有機(jī)添加劑協(xié)同作用來改善分離效果是可行的。Bailon-Perez等采用毛細(xì)管電泳-串聯(lián)質(zhì)譜(CE-MS/MS)法檢測(cè)了雞肉中9種PENs(蔡夫西林、雙氯西林、氯唑西林、苯唑西林、氨芐西林、青霉素G、阿莫西林、青霉素V和哌拉西林)殘留。雞肉樣品經(jīng)乙腈提取后，采用OasisHLB柱和氨基柱分別進(jìn)行凈化，CE分離柱為填充硅膠柱(96cm×360μm，50um)，緩沖液為60mmoL/L醋酸銨緩沖液(pH6.0)，離子阱質(zhì)譜儀(MSn)，ESI電離源，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式檢測(cè)。該方法測(cè)得雞肉樣品的LOD為8～12μg/kg。

(4)氣相色譜法(gaschromatography，GC)

β-內(nèi)酰胺類藥物為強(qiáng)極性、熱不穩(wěn)定性和難揮發(fā)性化合物，采用GC測(cè)定時(shí)，需要進(jìn)行甲酯化衍生反應(yīng)來提高其揮發(fā)性和降低極性。常用的檢測(cè)器主要有氮磷檢測(cè)器(nitrogen-phosphorus detector，NPD)和質(zhì)譜檢測(cè)器(mass spectrometry detector，MSD)等。由于GC方法前處理步驟繁鎖，目前已很少用于β-內(nèi)酰胺類藥物殘留的實(shí)際檢測(cè)。Preu等建立了牛肉中青霉素的GC同位素稀釋檢測(cè)方法。樣品經(jīng)乙腈和磷酸鹽緩沖液(pH2.2)提取，NaCl、二氯甲烷和Na2SO4除去水，旋轉(zhuǎn)蒸干后，分別采用石油醚/磷酸鹽緩沖液(pH7)、磷酸鹽緩沖液(pH7)億醚、磷酸鹽緩沖液(pH7)/二氯甲烷、磷酸/二氯甲烷進(jìn)行LLP，然后采用陰離子交換柱進(jìn)行凈化，再用磷酸鹽緩沖液(pH2.2)/二氯甲烷進(jìn)行LLP凈化，氮吹蒸干后，用重氮甲烷進(jìn)行衍生化，使用GC-NPD或GC-MS進(jìn)行檢測(cè)。采用熔融石英的交聯(lián)甲基聚硅氧烷膠毛細(xì)管柱(30m×0.25mm，0.25um)進(jìn)行分析，程序性升溫模式分離，電子電離(EI)，選擇離子(SIM)模式監(jiān)測(cè)。該方法測(cè)得青霉素的LOD為3ug/kg。該試驗(yàn)比較了使用不同內(nèi)標(biāo)和不使用內(nèi)標(biāo)檢測(cè)青霉素G的區(qū)別，發(fā)現(xiàn)使用13C同位素內(nèi)標(biāo)回收率較好。Meetsehen等用GC測(cè)定牛奶和動(dòng)物組織中7種PENs。用重氮甲烷衍生化，形成易揮發(fā)的青霉素甲基酯類化合物，有效提高了檢測(cè)靈敏度和再現(xiàn)性。采用毛細(xì)管柱(30m×0.26mm，0.1um)進(jìn)行分析，程序升溫模式分離，進(jìn)樣體積3μL。方法回收率在46%～73%之間，牛奶和組織中PENs的LOD小于3μg/kg。

上一篇：蜂蜜中5種頭孢菌素殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法適用范圍和方法原理

下一篇：β-內(nèi)酰胺類藥物的殘留檢測(cè)（二）