β-受體激動劑類藥物殘留量的測定公定方法（四）

[db:作者] / 2022-12-08 00:00

1.2.1.7 分析條件的選擇

(1)提取凈化條件的選擇

1)提取溶劑的選擇

β-興奮劑的提取方法主要有液液提取法和固相提取法(SPE)。除飼料中因直接添加β-興奮劑外，β-興奮劑在生物體內(nèi)經(jīng)過吸收、轉(zhuǎn)化、代謝，部分β-興奮劑可能成為結(jié)合型，如與葡糖苷酸酶、硫酸酯蛋白相結(jié)合。Boyd等l曾做過對比試驗，比較有無酶水解步驟對沙丁胺醇測試結(jié)果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酶水解后所測得的結(jié)果明顯高于未水解的(采用RIA方法測試)，有40%～45%沙丁胺醇是以結(jié)合物形式存在于肝樣品中。而Haasnoot等山報道，費諾特羅在尿樣中大約85%是以葡糖苷酸酶化-硫酸酯蛋白化結(jié)合物形式存在，但是對于克倫特羅沒有數(shù)據(jù)證明是以結(jié)合的形式存在。

水解主要包括酸解和酶解。酶制劑本身及其水解的樣品往往可產(chǎn)生大量干擾物質(zhì)，且酶解條件受酶種類、樣品基質(zhì)及水解條件不同而有所不同，而酸解的分析結(jié)果與酶解相近，且產(chǎn)生的干擾物質(zhì)較少。本方法采用酸解方式進行水解，除使可能以結(jié)合態(tài)形式存在的化合物游離出來外，同時也使樣品基質(zhì)分散，便于提取。

樣品中β-興奮劑常見的提取溶劑有甲醇、乙酸乙酯、叔丁基甲醚、乙酸乙酯-異丙醇、乙酸乙酯-正丁醇等。本方法結(jié)合12種β-興奮劑不同的極性，采用不同比例的乙酸乙酯-異丙醇進行提取(添加水平5.0ug/kg，提取一次)，結(jié)果見表1-6，如果提取溶劑中異丙醇比例過高，會出現(xiàn)不容易分層，而且濃縮不干的情況，所以，本實驗中采用15mL乙酸乙酯-異丙醇(4+6，v/v)提取一次后，再采用10mL乙酸乙酯-異丙醇(7+3，v/v)進行提取，提取回收率比較好，而且容易操作。

表1-6不同比例的乙酸乙酯-異丙醇混合溶劑對β-興奮劑的提取回收(添加水平5.0ug/kg)

2)pH的選擇

根據(jù)β-興奮劑在酸性情況下溶于水溶液，在堿性情況下溶于有機溶劑，本實驗中將12種β-興奮劑在不同pH的乙酸鈉緩沖液(0.2mol/L)用乙酸乙酯-異丙醇(4+6，v/v)進行提取，得到結(jié)果見圖1-6(添加水平10.0ug/kg)，因此本方法中調(diào)節(jié)pH為9.4～10范圍內(nèi)進行有機溶劑的提取，提取效率對12種β-興奮劑都較為穩(wěn)定。

圖1-6 β-興奮劑在不同pH的提取回收情況

3)凈化方法

β-興奮劑最常用的凈化手段是固相萃取法(SPE)、免疫親和色譜法(IAC)和液液凈化法等。常用于β-興奮劑提取的固相柱有硅藻土、C2、C8、C18、硅膠、強陽離子交換柱和弱陽離子交換柱等，所用的SPE柱有Bond Elut C18柱、C18和硅酸柱、酸洗硅酸柱、Bond-EIm Certify柱、Clean screen DAU cartridge柱等，也有用C18柱與SCX離子交換樹脂串聯(lián)的凈化方法。本方法采用C18與SCX結(jié)合性質(zhì)的Oasis MCX固相萃取柱，取得了良好的凈化效果，并比較了Oasis MCX與SCX的洗脫曲線，見圖1-7。從圖1-7中可以看出，至少要6mL 5%氨水甲醇溶液才能完全洗脫SCX柱上的沙丁胺醇。因此，實驗中采用5%氨水甲醇溶液5mL洗脫，12種β-興奮劑都取得了較好的回收率。

4)過濾膜的影響

取含12種β-興奮劑的標準溶液分別過0.22um有機相和水相濾膜，發(fā)現(xiàn)有機相濾膜對克倫特羅，妥布特羅有明顯的吸附作用，而過水相濾膜基本上沒有損失，因此本方法采用過水相濾膜后進樣。

圖1-7 12種β-興奮劑在MCX與SCX固相萃取柱上的洗脫曲線

洗脫溶劑：5%氨水甲醇溶液，1～3為淋洗液，4～12為洗脫液

5)基質(zhì)干擾實驗

因上樣液中的雜質(zhì)對β-興奮劑藥物的檢測有一定基質(zhì)效應(yīng)，所以本方法中的標準曲線都是以空白基質(zhì)的提取液來稀釋和配置的。

(2)儀器條件的選擇

1)內(nèi)標法和外標法的比較

由于所分析的12種化合物的結(jié)構(gòu)差異比較大，研究中對內(nèi)標法和外標法定量進行了比較，由于尚不能獲得12種化合物的同位素內(nèi)標，本方法采用萊克多巴胺、克倫特羅、沙丁胺醇三種同位素內(nèi)標，實驗證明內(nèi)標法定量準確性明顯高于外標法，尤其是對沙丁胺醇和特布它林這種絕對回收率較低的藥物，回收率明顯改善，這主要是由于同位素內(nèi)標能很好地校正方法過程中的損失，以及基質(zhì)帶來的干擾和影響。因此，選擇內(nèi)標法定量。

2)檢測條件的確定

按照質(zhì)譜測定的一般要求，先對各化合物進行全掃描，隨后對每個化合物確定掃描離子，采用選擇離子模式以提高其檢測靈敏度。選擇兩對離子進行MRM監(jiān)測即可滿足，其中母離子和子離子按照每種化合物的質(zhì)譜圖和結(jié)構(gòu)特性選取。

在所分析的化合物中，各物質(zhì)極性強弱不同，如特布它林、沙丁胺醇等含有極性較強的酚羥基官能團，而克倫特羅和萊克多巴胺極性相對較弱，因此需要采用梯度洗脫方式來進行分離。試驗證明，在梯度洗脫條件下這12種物質(zhì)均能較好分離。

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