四環(huán)素類(lèi)藥物殘留分析技術(shù)——測(cè)定高效液相色譜法（一）

時(shí)間：2023-03-25 01:45:30來(lái)源：food欄目：食品快速檢測(cè) 閱讀：

四環(huán)素類(lèi)藥物殘留分析技術(shù)——測(cè)定高效液相色譜法（一）

[db:作者] / 2022-12-19 00:00

(6)高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)

HPLC的靈敏度、特異性高，可用于動(dòng)物血液、肌肉、肝臟、腎臟等樣品中TCs殘留量的分析。由于TCs易與反相硅膠柱上殘留的硅醇基產(chǎn)生不可逆性吸附，導(dǎo)致色譜峰拖尾，因此通常需要在流動(dòng)相中加入各種掃尾劑，如草酸、磷酸、檸檬酸、甲酸及磷酸氫二鈉等，以改善峰形。目前，用于TCs的HPLC分析的主要有紫外檢測(cè)器(UVD)、熒光檢測(cè)器(FLD)、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器(CLD)、電化學(xué)檢測(cè)器(ECD)等。

1)紫外檢測(cè)器(ultraviolet detection，UVD)

TCs有很好的紫外吸收特性，摩爾吸收系數(shù)較大。它們?cè)谒嵝匀芤褐械淖贤庾畲笪詹ㄩL(zhǎng)一般在350～380nm之間，而在這個(gè)波長(zhǎng)段附近，體液和組織內(nèi)的化合物很少有吸收，因此干擾較少，可提高靈敏度。采用UVD或二極管陣列檢測(cè)器(DAD/PDA)檢測(cè)，其檢測(cè)限可以達(dá)到ng/g或ng/mL。對(duì)不同的樣品，通過(guò)選擇合適的流動(dòng)相，可以提高其選擇性，改善色譜峰形，降低信噪比；而且分析時(shí)間一般較短(8～16min)。

Samanidou等對(duì)牛肉中MNC、OTC、TC、CTC、DC殘留進(jìn)行HPLC-DAD檢測(cè)。以0.3mol/L檸檬酸溶液(pH4)提取樣品，采用高交聯(lián)度的球狀聚合體吸附劑為填料的萃取柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化，以甲醇-乙腈-0.01mol/L草酸溶液(30+30+40，v/v)為洗脫劑對(duì)5種TCs進(jìn)行洗脫。在濃度為0.5～15.0μg/mL線(xiàn)性范圍內(nèi)，牛肉樣品的加標(biāo)回收率為98.7%～103.3%，方法的LOQ為25.0～40.0ug/kg。該實(shí)驗(yàn)以氨基苯甲酸為內(nèi)標(biāo)物加入到所測(cè)樣品中，降低了因被測(cè)物性質(zhì)不穩(wěn)定帶來(lái)的誤差，結(jié)果重現(xiàn)性好。龐國(guó)芳等建立了HPLC-UVD法同時(shí)測(cè)定禽肉中TC、OTC、CTC和DC殘留的分析方法。禽肉樣品用0.1mol/L Na2EDTA-Mllivaine緩沖液提取，上清液用HLB固相萃取柱和Carbolicacid陰離子交換柱凈化，用流動(dòng)相洗脫定容后，用UVD于350nm測(cè)定。在5～100mg/kg添加水平，回收率為60%～100%，RSD在16%以?xún)?nèi)：TC、OTC的LOD為2mg/kg，CTC和DC的LOD為5mg/kg。Ryuji等提出了一種簡(jiǎn)化了的食用魚(yú)和小蝦中藥物殘留的HPLC檢測(cè)方法。測(cè)定TC和OTC時(shí)，以甲醇-草酸(1+9，v/v)的混合溶液為流動(dòng)相，用28%的氨水調(diào)節(jié)pH7.0，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)360nm，在信噪比(S/N)為3時(shí)LOD為0.02ug/g。Shalaby等通過(guò)對(duì)不同方法的每一步評(píng)價(jià)，優(yōu)化并驗(yàn)證了一種測(cè)定雞肉和肝臟中TC殘留的HPLC-DAD分析方法。該方法采用2mL 20%的三氯乙酸和檸檬酸鹽緩沖液(pH4)進(jìn)行UAE提取，離心后取上清液，經(jīng)C18固相萃取柱凈化后，用反相色譜柱(Nuclosil 100 1825cm×4.6mmid，5μm)梯度洗脫，DAD在351nm檢測(cè)。結(jié)果表明，在線(xiàn)性范圍為50～5000ng時(shí)，校準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性關(guān)系良好(2大于等于0.999)；雞肉及肝臟中的準(zhǔn)確度分別為71.88%～92.44.3%和68.88%～84.84%，精密度均低于10%；OTC、TC、CTC和DC的LOD分別為4.4ng、5ng、13ng和10ng，LOQ分別為10ng、13ng、27ng和22ng。Yu等建立了一種簡(jiǎn)單、快速定量測(cè)定豬、雞和牛肌肉和肝臟樣品中OTC、TC、CTC、MNC、MTC、DMCT和DC的HPLC分析方法。使用ASE儀以三氯乙酸/乙腈溶液萃取HPLC-UVD檢測(cè)。肌肉和肝臟中所有化合物的LOD均低于10μg/kg，LOQ不超過(guò)15ug/kg；平均回收率為75.0%～104.9%，RSD小于10%。Lee等采用HPLC方法分析韓國(guó)市場(chǎng)上牛肉、豬肉、雞肉、鰻魚(yú)、比目魚(yú)、石斑魚(yú)、鯛魚(yú)、鱸魚(yú)和牡蠣樣品中的TCs等13種抗生素。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，豬肉和鰻魚(yú)中OTC的含量分別為0.01mg/kg和0.05mg/kg。Fletouris等建立了可食性動(dòng)物組織中OTC及其代謝物4-epiOTC的離子對(duì)HPLC分析方法。樣品用2mol/L硫酸調(diào)pH2.7，乙腈提取，經(jīng)硫酸銨溶液和0.1mol/L磷酸凈化后，HPLC-UVD測(cè)定。Nucleosil 100-5 C18色譜柱分離，乙腈-0.01mol/L磷酸氫二鈉(20+80，v/v，含四丁基銨和辛烷磺酸鹽，pH3.8)等度洗脫，UVD在370nm測(cè)定。方法回收率超過(guò)82.6%，RSD小于6%；肌肉和脂肪中的LOQ為30ng/g，肝臟和腎臟中的LOQ為50ng/g。

張素霞等建立了牛奶中TCs殘留的HPLC-UVD分析法。用MSPD技術(shù)處理樣品，以甲醇乙腈-0.01mol/L草酸(2+3+5，v/v)為流動(dòng)相，C18色譜柱(250mm×4.6mmi.d，5μm)分離，流速為1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為365nm，進(jìn)樣體積為20μL。在0.1～0.5μg/mL添加濃度范圍內(nèi)，4種TCs(CTC、TC、OTC和DC)的平均回收率為78.7%～90.2%，CV在2.4%～18.8%之間，測(cè)得樣品的LOD為0.02～0.05ug/mL。Kaale等采用PS/DVB為填料的反相柱檢測(cè)牛奶中OTC殘留。以20%(v/v)三氣乙酸沉淀蛋白，乙酸-水(pH4.5)-乙腈(4+68+28，v/v)為流動(dòng)相，UVD檢測(cè)波長(zhǎng)為354nm。在100～1000ng/mL范圍內(nèi)呈良好線(xiàn)性(2-0.995)，日內(nèi)RSD為0.8%，樣品中OTC的LOD為30ng/mL該方法無(wú)需使用離子對(duì)試劑，結(jié)果有較高的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。Furuawa建立了采用非有機(jī)溶劑測(cè)定牛奶中OTC殘留的HPLC-DAD分析方法。該方法沒(méi)有采用常用的C18柱或C8柱，而是用C4柱分離，TCs更不易保留，所需的流動(dòng)相有機(jī)極性強(qiáng)度和量均減小，可采用無(wú)有機(jī)溶劑的流動(dòng)相。OTC在0.1～1.0μg/mL添加濃度范圍，回收率為80%～84%，RSD為4.2%～5.3%；LOQ為0.08ug/mL。Fletouris等報(bào)道了采用離子對(duì)HPLC分析羊奶中OTC殘留標(biāo)示物的方法。樣品經(jīng)酸化，用乙腈提取，硫酸銨溶液和磷酸凈化后，HPLC-UVD測(cè)定。Nucleosil C18色譜柱分離，同時(shí)含有正負(fù)電荷的離子對(duì)試劑為流動(dòng)相。方法回收率超過(guò)86%，RSD小于4.6%；LOD為20μgkg。Fritz等開(kāi)發(fā)了同時(shí)測(cè)定牛奶中TC、4-epiTC和OTC的反相HPLC-PDA方法。牛奶經(jīng)提取后用DiscoverySPE DSC-18柱凈化，室溫下用WatersSymmetry C18色譜柱分離，0.01mol/L草酸溶液-乙腈～甲醇(150+20+20，v/v)為流動(dòng)相，整個(gè)分析小于8min。方法LOD為2.0ug/L；在添加濃度0.25ug/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL和1.5ug/mL，TC、4-epiTC和OTC的平均回收率分別為91.5%、71.5%和83.1%，日內(nèi)RSD小于4%，日間小于7%。

Vias等采用反相HPLC-UVD測(cè)定蜂蜜中的TCs。采用弱酸性溶液(含EDTA，以釋放蛋白和糖結(jié)合態(tài)的藥物)提取，苯基SPE柱凈化后，HPLC-UVD測(cè)定。色譜柱鍵合的酰胺基固定相阻斷了TCs與殘留硅醇基的結(jié)合，避免了拖尾峰的出現(xiàn)。以乙腈和草酸為流動(dòng)相梯度洗脫，所有藥物分離良好。方法線(xiàn)性、準(zhǔn)確度、靈敏度、精密度均滿(mǎn)足殘留分析要求，LOD在15～30ng/g之間。

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