喹噁啉類藥物殘留測定方法——高效液相魚譜法

時間：2023-03-24 23:59:40來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

喹噁啉類藥物殘留測定方法——高效液相魚譜法

[db:作者] / 2022-12-21 00:00

(3)高效液相魚譜法( high performance liquid chromatography， HPLC)

喹噁啉類藥物及其代謝物多屬中等極性，大多選用反相HPLC分離，流動相主要選用甲醇、乙腈和水，通過調節三者比例和梯度條件，各藥物可得到較好的分離；同時，流動相的pH影響待測物的存在形態，需要注意選擇合適的pH范圍。本類藥物及其代謝物的共平面共軛結構，具有紫外吸收特性。QCA和MQCA都有三個較強的吸收峰，吸收波長分別為204nm、 245nm和320nm；其他幾種藥物的UV-Vis吸收圖見圖15-3。因而，本類藥物HPLC檢測最常用的檢測器為紫外檢測器(ultraviolet detector，UVD)和二極管陣列檢測器(diode-array detector，DAD；photo-diode array detector，PDA)。

圖15-3幾種喹噁啉類藥物的UV-Vis光譜圖

(a)CYX；(b)BDCYX

1)直接測定

Nasr等優化和驗證了一個測定雞肉、雞肝、牛肉、牛肝和牛奶中CBX和OLQ殘留量的HPLC方法。采用C18柱分離，以10%乙腈和含0.3%三乙胺的0.02mol/L磷酸緩沖液(pH4)作為流動相，梯度洗脫，在373nm波長檢測。該方法能夠在四分鐘能完成分析測定，CBX和OLQ的回收率分別在89.2%～93.6%和93.0%～107.2%范圍內。張小軍等用HPLC測定動物組織中OLQ殘留標示物MQCA。色譜柱為Sunfire C18柱(250 mm×4.6mm，5um)，流動相為甲醇-1.0%甲酸(40+60，v/v)，流速1.0mL/min，柱溫30℃，進樣量50μL，檢測波長320nm。豬肉、牛肉、對蝦和草魚的回收率為82.1%～90.3%，LOQ為4.0μg/kg。實驗對同規格的ZORBAX SB-C18、Sunfire C18和X-Bridge C18三種色譜柱進行了比較，ZORBAX SB-C18和X-Bridge C18出峰較早，但有雜峰干擾，Sunfire C18出峰相對較晚，且分離效果好。實驗還比較了甲醇-1%甲酸(40+60，v/v)、甲醇-0.5%甲酸(30+70，v/v)兩組等度洗脫，以及甲醇、水和乙酸-乙酸鈉緩沖液梯度洗脫，發現以甲醇-1.0%甲酸(40+60，v/v)作為流動相時，色譜峰形和靈敏度最好。

QCA和MQCA等代謝物與喹惡啉類藥物原形極性差異較大，同一色譜條件不易操作，可以分別進樣測定。Huang等測定雞血液、肌肉、肝臟、腎臟和脂肪中CYX及其代謝物，HPLC色譜柱為ODS2(5um，250mm×4.6mm)，流速1mL/min，色譜柱溫度30℃。CYX和BDCYX的色譜檢測條件為：0～8min，乙腈-水(15+85，v/v)，紫外檢測波長305nm；8～15min，流動相線性轉化為乙腈-水(25+75，v/v)，檢測波長為280nm；而QCA的流動相為甲醇-水-甲酸(40+60+10，v/v)，檢測波長320nm。CYX和BDCYX的LOQ為0.025mg/kg(血和組織)，回收率在73%～87%之間，日間RSD小于9.86%；QCA的LOQ為0.025mg/kg(血和內臟組織)和0.02mg/kg(肌肉)；回收率為70%～87%，日間RSD為7.69%～11.43%。Zhang等用HPLC測定羊組織中的CYX、BDCYX和QCA。色譜柱為RP18(5um，4.6mm×250mm)，流速1mL/min。CYX和BDCYX的流動相為乙腈-水，梯度洗脫，紫外檢測波長分別為305nm和280nm；QCA的流動相為1%甲酸水-甲醇(6+4，v/v)，檢測波長為320nm。CYX的回收率為65%～79%，日間CV為6.7%～11.1%；BDCYX的回收率為70%～92%，日間CV為4.7%～15.9%；QCA回收率為70%～82%，日間CV為6.7%～11.1%；三種藥物的LOD均為15 μg/kg， LOQ為25 μg/kg。Huang等用HPLC測定豬、雞肉中QCT及其代謝物。色譜柱為Hyper sil ODS2(250mm×4.6mm)，流速1mL/min，QCT流動相：甲醇-水(55+45，v/v)，BDQCT 流動相：甲醇-水(7+3，v/v)，MQCA流動相：1%甲酸水-甲醇(6+4，v/v)，檢測波長為：312nm(QCT)、320nm(BDQCT和MQCA)。該方法回收率為71%～86%，CV為4%～12%；LOQ為0.05mg/kg，LOD為0.025mg/kg。

當代謝物與藥物原形同時進樣測定時，可以采用梯度洗脫，或者在流動相中添加酸，以降低pH，并增加在反相色譜上的保留性能。梅景良等建立了魚、蝦中OLQ和MQCA的HPLC檢測方法。色譜柱為Inertsil ODS-3 C18柱(250mm×4.6mm，5um)，流動相由純水、乙腈、甲醇和0.5%甲酸水組成，梯度洗脫，柱溫30℃，進樣量100μL，樣品運行時間為20min，雙波長檢測(OLQ為372nm，MQCA為320nm)。魚組織中OLQ和MQCA的LOD分別為6ugkg和10ug/kg，LOQ分別為20ug/kg和35μg/kg；蝦中的LOD分別為4.5μg/kg和8μg/kg，LOQ分別為15ug/kg和30μg/kg。Zhang等測定豬尿中MQX及其4種代謝物：1-脫氧乙酰甲喹、4-脫氧乙酰甲喹、BDMQX和MQCA。5mL樣品中加200μL甲醇和60μL四氯乙烷，超聲波萃取4min，離心后HPLC測定。C18色譜柱(5um，4.6mm×250mm)分離，流動相為甲醇-乙腈-水(26+26+48，v/v，含0.1%三氟乙酸)，流速1mL/min，進樣量10μL，檢測波長320nm。方法LOD為0.16～0.28μg/L，回收率為72.0%～91.3%，CV小于5.2%。Wu等檢測動物肌肉、肝臟和魚肉中MQCA和QCA，用Eclipse XDB C18色譜柱(250mm×4.6mmid.)分離，柱溫30℃，流動相為甲醇-1%甲酸(35+65，v/v，pH2.7～3.1)，流速1.0mL/min，檢測波長為320nm。QCA和MQCA的CCa為0.7～2.6μg/kg，CCβ為1.3～5.6μg/kg，回收率為70%～110%，CV小于20%。

2)柱后衍生測定

1-脫氧卡巴氧和4-脫氧卡巴氧主要采用HPLC柱后衍生方法測定。Aerts等測定豬肝、肌肉、腎臟中CBX、BDCBX、1-脫氧卡巴氧和4-脫氧卡巴氧殘留，采用柱切換HPLC系統-柱后衍生化檢測。富集柱為C18 Corasil(60mm×4.6mm，3～5.0um)，流動相為水，流速0.6mL/min；色譜分析柱為C18柱(200mm×3mm，5um)，流動相為0.01mol/L乙酸鈉緩沖液(乙酸調節pH6)-乙腈(85+15，v/v)，流速0.5mL/min；柱后衍生試劑為0.5mol/L氫氧化鈉溶液，流速0.3mL/min，衍生化反應管(2m×0.5mm)；420nm檢測。時間序列為：0min，進樣和淋洗；20min，切換六通閥柱反沖，檢測器自動調零；25min，復位六通閥；35min，結束。該方法各藥物的LOD為0.5～1μg/kg(CBX)、2～3μg/kg(BDCBX)、1～2μg/kg(1-脫氧卡巴氧和4-脫氧卡巴氧)；回收率在81%～87%之間，CV為4%～10%。但是，在這種色譜條件下，QCA不保留，出峰過早與溶劑雜質峰重合而無法檢測。Binnendjk等也采用柱切換HPLC-柱后衍生的方法測定動物產品中CBX及其代謝物。富集柱為Sep-Pak C18(10mm×2.1mm)，流動相為水，流速0.3mL/min；色譜分析柱為Chromaspher C18 (100mm×3mm)，流動相為0.01mol/L乙酸鈉緩沖液(乙酸調pH6)-乙腈(86+14，v/v)，流速0.5mL/min；柱后衍生試劑為0.5mol/L氫氧化鈉溶液，流速0.23mL/min，衍生化反應管(2m×0.5mm)；390nm檢測。時間序列為：0min，進樣和淋洗；20min，切換六通閥柱，檢測器自動調零；25min，復位六通閥；35min，結束。豬腎、肌肉和肝中CBX的LOD為0.5～1μg/kg，BDCBX為0.5～2μg/kg；回收率為83%～95%，RSD小于14%。該法還適用于d血漿和蛋中CBX的測定，回收率在70%～80%之間。

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