四環(huán)素類藥物殘留分析技術(shù)——測定薄層色譜法

時(shí)間：2023-03-25 01:46:58來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

四環(huán)素類藥物殘留分析技術(shù)——測定薄層色譜法

[db:作者] / 2022-12-19 00:00

(3)薄層色譜法(thin layer chromatography，TLC)

TLC是一種設(shè)備簡單、操作方便、分離速度快、靈敏度及分辨率較高的色譜分析方法。張啟華等報(bào)道了蜂蜜中TCs殘留量的薄層色譜測定法。殘留在蜂蜜中的TCs在經(jīng)Sep-Pak C18小柱固相萃取處理后，用高效正相硅膠TLC分離，展開劑為：氯仿-乙酸乙酯-甲醇-乙腈-5.0mol/L氨水(3+1+3+0.5+1，v/v)，待展開距離達(dá)到75mm時(shí)取出。展開劑揮發(fā)后，先后噴上0.20mol/L的氯化鎂溶液和100g/L的三乙醇胺-乙醇溶液，晾干后用紫外燈在365nm下觀察熒光點(diǎn)。對陽性樣品利用薄層掃描儀在狹縫2×2、測定波長280nm、參比波長320nm的條件下進(jìn)行反射吸收測定。根據(jù)標(biāo)樣中DC、OTC、TC的Rf值與樣點(diǎn)中抗生素的Rf值來定性，利用外標(biāo)法進(jìn)行定量。在蜂蜜中的添加量為0.05ng、0.10ng、0.20ng時(shí)，DC、OTC和TC的回收率分別為91.6%～100.3%、84.5%～103.1%和77.0%～103.2%，DC、OTC、TC的LOD分別為：7.09ng、5.49ng和6.11ng。Weng等開發(fā)了采用TLC測定飼料中TC、CTC和OTC的方法。硅膠層先用10% Na-EDTA(pH8～9)噴涂，在二氯甲烷-甲醇-水中展開后，浸漬在液體石蠟-己烷(30+70，v/v)中，在熒光密度400nm下檢測。方法LOQ為TC和CTC雜質(zhì)的0.2%，OTC雜質(zhì)的0.1%。Meisen等報(bào)道了采用高效薄層色譜(HPTLC)-紫外光譜(UV)和紅外線基質(zhì)輔助激光解吸/電離正交飛行時(shí)間質(zhì)譜(IR-MALDI-o-TOF-MS)測定4種TCs的方法。分析物在正相硅膠和水可濕潤的混合C18反相層展開分離后，UV測定，分離的、明確標(biāo)識的TCs譜帶再用MS分析。定量范圍在20ng～1ug之間，LOD為5ng。

(4)流動注射法(flow-injectionanalysis，F(xiàn)IA)

FIA是一種可擺脫溶液化學(xué)分析平衡理論的束縛，在非熱力平衡條件下對處于液流中能夠重現(xiàn)處理樣品和試劑帶區(qū)的定量流動分析技術(shù)，具有精度高、分析速度快以及易于實(shí)現(xiàn)自動化等特點(diǎn)。

王皓等采用FIA-化學(xué)發(fā)光法(chemiluminescence，CL)法測定血樣和尿樣中的DC。在0.8mol/L的HNO3酸性介質(zhì)中，DC與0.5mmol/L的Ce(IV)反應(yīng)，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，采用10umol/L的羅丹明6G增敏，蠕動泵的轉(zhuǎn)速為30r/min，利用FIA技術(shù)建立了簡易、快速測定DC的化學(xué)發(fā)光法。化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度在1.0×10-8～1.0×10-6 g/mL范圍內(nèi)與DC的濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系；LOD為2×10-9 g/mL；測定血樣和尿樣中的DC回收率為97%～117.4%，CV低于4.5%。Rodriguez等采用FIA-分光光度法檢測牛奶中CTC、TC和OTC殘留。牛奶樣品直接經(jīng)MSPE凈化，酸化甲醇洗脫，F(xiàn)IA分離，紫外可見分光光度計(jì)在540nm處檢測。該方法的線性范圍為0.03～0.60mg/L，LOD為10μg/L，平均回收率為91.0%～97.0%，CV低于5%。經(jīng)MSPE-HPLC和SPE-HPLC方法驗(yàn)證，差異不顯著。

(5)毛細(xì)管電泳法(capillary electrophoresis，CE)

CE具有操作簡單、色譜柱不受樣品污染、分析速度快、分離效率高、樣品用量少、運(yùn)行成本低等優(yōu)點(diǎn)。

陳天豹等用CE對蜂蜜中的TC、OTC、DC和CTC進(jìn)行了分離測定。毛細(xì)管為50umi.d.×57cm(有效長度50cm)，毛細(xì)管在每次使用前先用0.1mol/L的NaOH在高壓(138kPa)下清洗5min，后用水洗5min，再用電泳緩沖液洗2min。TCs的等電點(diǎn)(pI)在4～6，在pH2～8范圍內(nèi)較穩(wěn)定。磷酸氫二鈉-檸檬酸的pH緩沖范圍為2.6～7.6，且磷酸鹽和檸檬酸在短波長下光吸收低，不會增加基線噪音，降低了可檢測濃度，隨pH的降低，毛細(xì)管表面的負(fù)電荷減少，電滲流減弱，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示出峰時(shí)間相應(yīng)延長，pH3.2時(shí)分離效果較佳。電泳緩沖液中添加一種或幾種有機(jī)試劑，對樣品的溶解性、電滲流大小和分辨率等都有較大的影響。TCs在磷酸氫二鈉_檸檬酸電泳緩沖液中溶解性較差，因此需在電泳緩沖液中添加一定量的乙腈以解決溶解性差的問題，方法采用的緩沖液為0.02mol/L磷酸氫二鈉-0.01mol/L檸檬酸緩沖液(pH3.2，含體積分?jǐn)?shù)為12%的乙腈)。蜂蜜樣品經(jīng)水稀釋后1000r/min離心5min，CE-UVD檢測，檢測波長為270nm。TC、OTC和DC的LOD為20ug/L，CTC為40μg/L，回收率大于89.6%，CV為0.5%～3.4%。Casado-Terrones等用毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)分離檢測蜂蜜中的8種TCs以150mmol/L硼酸鈉(pH9.8)-2.5%異丙醇作背景緩沖溶液，目標(biāo)抗生素在16min內(nèi)全部出峰，LOD為23.9～49.3mg/kg，蜂蜜的加標(biāo)回收率為55%～89%。

Kowalski采用帶有泡狀檢測池的CE在6min內(nèi)對魚肉樣品中的TC、OTC和DC進(jìn)行了檢測。

方法使用石英毛細(xì)管柱(57cm×75umi.d.)，3.45kPa壓力進(jìn)樣5s，分離電壓為20kV，分離溫度為22℃，UVD在270～280nm檢測。TC、OTC和DC的回收率分別為84.0%、80.6%和89.2%，CV低于6.2%，LOD為1.3～1.8ng/g，LOQ為4.3～5.9ng/g。Miranda等開發(fā)了測定雞肉中TC、OTC和DC的CZE-UVD分析方法。樣品經(jīng)C18 SPE和AmberliteXAD7離子交換樹脂凈化后，進(jìn)CE分析。

分離緩沖液含有30mmol/L磷酸鈉、2mmol/L Na2EDTA和2.5% 2-丙醇(pH12)，分離電壓14kV，動態(tài)注入5s，360nm測定。整個(gè)分析時(shí)間小于12min。方法回收率為85%～95%，RSD小于5%；C18 SPE凈化方法的LOD為61～68μgkg，AmberliteXAD7凈化方法的LOD為81～89μg/kg。

Nozal等報(bào)道了采用CE測定水樣中TC、OTC和DC的方法。樣品采用STRATA-X小柱富集凈化，經(jīng)流歧管與CE在線分析。方法分析范圍在7～45g/L之間，LOD為2g/L；回收率為9%～106%，RSD小于7.5%。

Mu等建立了牛奶中TC、OTC和DC殘留的CE分析法。樣品經(jīng)MSPD凈化，CE分析，電泳緩沖液為30mmol/L Na2HPO4和1mmol/LEDTA-Mellvaine緩沖液(pH11.5)，石英毛細(xì)管柱(50cm×75um i.d，有效長度40.5cm)分離，30mbar壓力進(jìn)樣3s，分離電壓為25kV，分離溫度為25℃，UVD在268nm檢測。方法的平均回收率為93.4%～102%，LOD為0.0745～0.0808μg/mL。Santos等報(bào)道了采用CE分析牛奶中TC等抗生素的殘留分析方法。樣品經(jīng)沉淀蛋白后，用C18SPE柱凈化，CE測定。毛細(xì)管柱為熔融硅膠柱(58.5cm×75umi.d.)，分離緩沖液為2.7×10-2 mol/L KH2PO4和4.3×10-2 mol/L Na2B4O7緩沖液(pH8)，分離電壓為18kV，0.5psi靜態(tài)注入3s，分離溫度為25℃，UVD在210nm測定。在添加濃度2.5～5μg/mL，回收率超過72%，RSD小于5%。Wang等以場強(qiáng)樣品堆積-電遷移注射在線富集，毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用(CE-MS)檢測牛奶中的TCs。35mmol/L三羥甲基氨基甲烷-1.1%甲酸-5%甲醇-15%乙腈作為分離緩沖溶液，方法LOD為7.14～14.90ng/mL。研究表明，與未在線富集方法相比，場放大進(jìn)樣檢測靈敏度提高6～7倍；將毛細(xì)管檢測部分折成“Z”字形，加熱吹成泡狀是增加檢測靈敏度的有效措施。

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