甾類同化激素類藥物殘留分析技術(shù)測定方法（一）

[db:作者] / 2022-12-13 00:00

8.1.4.2 測定方法

有關(guān)動物源基質(zhì)中ASs殘留檢測方法的報道很多，主要是免疫分析法和色譜分析法。免疫分析法主要有酶聯(lián)免疫測定法(ELISA)、放射免疫測定法(RIA)和膠體金免疫試紙法(GICA)；色譜分析法主要有氣相色譜法(GC)、氣質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS)、高效液相色譜法(HPLC)和液質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS)。長期以來，GC-MS和ELISA一直是ASs殘留分析的主要手段；但近年來，HPLC和LC-MS的應(yīng)用越來越多，新的篩查技術(shù)(如分子生物學(xué)檢測方法)也開始有研究報道。

(1) 氣相色譜法(gaschromatography，GC)

GC以氣體為流動相，用于殘留藥物的檢測，具有高效能、高選擇性、高靈敏度、分析速度快和應(yīng)用范圍廣等特點。對于ASs殘留分析，較早之前有過相關(guān)報道，但已逐漸被GC-MS方法取代。李青等建立了GC-ECD測定畜禽肉及內(nèi)臟中雌二醇?xì)埩袅康姆椒ā２捎靡颐押褪兔烟崛。D(zhuǎn)蒸干后，石油醚溶解殘渣，甲醇-水(4+1，v/v)LLP凈化，在吹干的試樣殘渣中加入1mL HFBA，超聲20min，再用氮氣吹干，加入0.5mL異辛烷，混勻后GC-ECD檢測。色譜柱為SE-54，載氣為氦氣，進樣口溫度為290℃，檢測器溫度為300℃。方法LOD為0.5μg/kg，回收率為84.0%～93.0%。

(2)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(gaschromatography-massspectrometry，GC-MS)GC-MS法是目前ASs殘留檢測中采用較多的方法。在各國頒布的標(biāo)準(zhǔn)方法中，GC-MS通常作為其最后的確證方法。ASs可以采用電子電離(EI)和化學(xué)電離(CI)的方式檢測。

1)電子電離(EI)

Fritsche等建立了牛肌肉組織中雄激素、雌激素的GC-MS檢測方法。極性ASs通過甲醇-水混合液提取后，用C18 SPE柱凈化，而非極性ASs則需要氨基柱進一步凈化，最后混合后用MSTFA-TMIS-DTE(1000+2+2，v/v)硅烷化衍生，GC-MS測定。分析柱為DB-5 mS毛細(xì)管柱，載氣為氮氣，進樣口溫度260℃，質(zhì)譜接口溫度290℃，EI源，電子能量為70eV，離子源溫度為180℃。該方法LOD為0.02～0.1μg/kg，C19和C21甾類激素的添加回收率分別為56%～79%和54%～114%。Seo等用GC-MS同時測定了雞肉中的雌二醇、睪酮等多種激素。樣品經(jīng)甲醇-水超聲波提取，冷凍后過濾除脂，C18 SPE柱凈化后，GC-MS測定。DB-1mS柱分離，載氣為氦氣，進樣口溫度為250℃，質(zhì)譜接口溫度為280℃，EI-SIM模式檢測。方法LOD可達0.1～0.4μg/kg，合成和天然生長激素的總體回收率為68%～106%。Marchand等利用GC-MS檢測肉中的23種ASs。通過LLP將ASs分為兩類：含D4-3-酮類和酚結(jié)構(gòu)類。兩類化合物分別在60℃和室溫，分別用MSTFA-TMIS-DTT和MSTFA-I2進行衍生，再用GC-MS測定。酚結(jié)構(gòu)藥物用MN-δ3柱分離，D4-3-酮類藥物用OV-1柱分離，進樣口溫度為250℃。該方法的LOD為5～100ng/kg。陳捷等建立了不同動物肌肉組織中ASs殘留的GC-MS檢測方法。樣品經(jīng)組織搗碎、用β-葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶溶液酶解和超聲提取后，用叔丁基甲醚萃取，再進行反相SPE凈化，衍生化后進行GC-MS測定。采用DB-1毛細(xì)管柱分離，載氣為He，不分流進樣，進樣口溫度280℃，接口溫度280℃，EI源，溶劑延遲10min。該方法LOD可達1.0～2.0μg/kg；在2.0μg/kg添加水平上，平均回收率可達62.5%～80.5%，RSD為12.5%～26.8%

Kootstra等建立了尿液中ASs多殘留檢測的GC-MS方法。采用了兩種不同的衍生化試劑：HFBA和TMS，主要用于定性和半定量分析低劑量的ASs。質(zhì)譜條件為：He為載氣，F(xiàn)actorFourVF-17MS色譜柱分離，EI離子源，SIM模式檢測，質(zhì)譜源溫度為250℃，四極桿溫度為120℃，進樣口溫度分別為260℃(HFBA衍生化產(chǎn)物)和250℃(TMS衍生化產(chǎn)物)。該方法在添加濃度為1μg/L時，測得ASs的CCa為0.06～0.77μg/L，CCβ為0.09～0.46ug/L；添加濃度為2μg/L時，測得ASs的CCa為0.26～0.54μg/L，CCβ為0.44～0.92μg/L。

圖8-4 19-去甲雄酮羰基衍生化反應(yīng)及其產(chǎn)物

圖8-5 19-去甲雄酮羥基衍生化反應(yīng)及其產(chǎn)物

Yamada等報道了采用GC-MS/MS同時檢測馬尿中蛋白同化類固醇主要代謝物的方法。尿液經(jīng)β-葡萄糖醛酸酶水解后，用Sep-Pak C18 PlusSPE柱凈化，再經(jīng)疊氮基三甲基硅烷衍生化后，GC-MS/MS離子源為EI源，在MRM模式下檢測。該方法的LOD為5～50ng/mL，平均回收率和CV分別為71.3%～104.8%、1.1%～9.5%。Gaillard等采用GC-MS/MS方法檢測了人頭發(fā)中的ASs。采用甲醇提取，堿性水解后，再用乙酸乙酯提取，用氨基柱和硅膠柱進行SPE凈化，MSTFA衍生化反應(yīng)后，GC-MS/MS分析。CPSIL 8 CB色譜柱分離，載氣為氦氣，脈沖不分流進樣，質(zhì)譜接口溫度為300℃，離子源溫度為160℃，四極桿溫度為70℃，初始爐溫為80℃；EI電離，碰撞氣為Ar。方法LOD小于等于6.2ng/g，平均添加回收率在61%～94%之間，日內(nèi)CV小于15.2%。Rambaud等建立了人頭發(fā)中ASs多殘留檢測方法。△4-3酮類化合物用MSTFA-TMIS-DTE(1000+5+5，v/v/w)衍生，群勃龍用MSTFA-I2衍生化，苯酚類固醇用MSTFA衍生后，GC-MS/MS分析。用0V-1毛細(xì)管柱分離，載氣為He，脈沖不分流進樣，質(zhì)譜接口溫度為320℃，碰撞氣為Ar，EI電離后采用SRM模式分析。方法LOQ可達0.1～10μg/kg，平均回收率為50%。

Impens等建立了牛尿中ASs多殘留的氣相色譜-離子阱質(zhì)譜(GC-MSn)檢測方法。采用非極性BPX-5柱(25m×0.22mm，ID 0.25um)分離，氦氣作為載氣，程序升溫，進樣口溫度為250℃，分流室氣流速度為60mL/min，采取無分流進樣模式；離子源溫度200℃，傳輸線溫度275℃，EI電離，離子化能量為70eV。當(dāng)GC-Ms2分析時，測得17種ASs的CCβ為1～10μg/L；GC-MS3分析時，測得CCβ為2～10μg/L，可用于ASs常規(guī)檢測。

2)化學(xué)電離(CI)

我國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T22967-2008采用GC-負(fù)化學(xué)電離源(NCI)-MS檢測牛奶和奶粉中β-雌二醇?xì)埩袅俊悠方?jīng)過β-葡糖苷酸酶和芳基硫酸苷酶水解和HLBSPE柱凈化后，用五氟苯甲酰氯衍生化(60℃放置15min)，再用GC-NCI-MS在SIM模式下測定，色譜柱為HP-5MS(30m×0.25mm，0.25um)，載氣為氦氣，梯度洗脫，流速1.0mL/min，選擇離子監(jiān)測，進樣量1μL，D4-B-雌二醇為內(nèi)標(biāo)定量。牛奶的LOD為0.25μg/kg，奶粉的LOD為2μg/kg。GB/T20749-2006采用類似的方法測定了牛尿中的β-雌二醇。

動物源基質(zhì)中ASs的部分GC-MS殘留檢測方法見表8-5。

表8-5 動物源基質(zhì)中ASs的部分GC-MS殘留檢測方法

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