硝基呋喃類代謝物最大允許殘留分析技術(shù)——測(cè)定方法（三）

時(shí)間：2023-03-25 05:38:39來(lái)源：food欄目：食品快速檢測(cè) 閱讀：

硝基呋喃類代謝物最大允許殘留分析技術(shù)——測(cè)定方法（三）

[db:作者] / 2022-12-12 00:00

(4)免疫分析法(immunoanalysis，IA)

免疫學(xué)分析方法是基于抗原-抗體特異性反應(yīng)建立起來(lái)的測(cè)定方法，具有簡(jiǎn)單、快速、處理樣品量大、靈敏度較高、特異性強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是假陽(yáng)性率較高。

1)酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)

Cooper等首先應(yīng)用AOZ的衍生物CPAOZ連接HAS制備完全免疫抗原，并成功得到敏感性高、特異性強(qiáng)的多克隆抗體，對(duì)除AOZ以外的NFs代謝物和其他化合物幾乎不存在交叉反應(yīng)。IC50值為0.065μg/L，可檢測(cè)出樣品中的AOZ的濃度為0.3μg/kg，為呋喃唑酮代謝物的免疫分析方法奠定了基礎(chǔ)。隨后，Cooper等又建立了蝦組織中AOZ的ELISA分析方法，方法檢測(cè)限為0.1μg/kg，批內(nèi)和批間RSD分別為18.8%和38.2%。Cheng等建立了魚中AOZ的ELISA檢測(cè)方法。通過(guò)得到敏感性和特異性較好的多克隆抗體，對(duì)樣品中經(jīng)衍生化反應(yīng)后的NPAOZ進(jìn)行檢測(cè)。兔多抗由免疫抗原(2-NP-HXA-AOZ)免疫產(chǎn)生，AOZ的IC50為0.14μg/kg，檢測(cè)限為0.025μg/kg，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于歐盟所要求的1μg/kg。應(yīng)用此方法，檢測(cè)了370份實(shí)際魚肉樣品，以AOZ的濃度為0.3μg/kg作為判定界限，此ELISA方法的敏感性為100%，與HPLC相比(0.3μg/kg)特異性為98.5%，并沒(méi)有出現(xiàn)假陰性結(jié)果。Diblikova等應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)動(dòng)物組織中AOZ的殘留量。對(duì)于蝦肉、禽肉、牛肉、豬肉的無(wú)假陽(yáng)性檢測(cè)濃度水平為0.4μg/kg，在蝦肉中添加濃度水平為0～32.1μg/kg的范圍內(nèi)，ELISA與LC-MS/MS方法的相關(guān)性為0.999，而在禽肉中添加濃度水平為0～10.5μg/kg的范圍內(nèi)，兩種方法的相關(guān)性也很好。沈美芳等的研究表明，運(yùn)用ELISA法測(cè)定水產(chǎn)品中AOZ殘留時(shí)，稀釋倍數(shù)對(duì)回收率影響顯著，乙酸乙酯提取次數(shù)、光照條件和放置時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著影響。用該方法對(duì)魚、蝦、蟹進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，0.60～6.00μg/kg加標(biāo)水平的回收率為87%～11.8%，CV為1.76%～12.57%。

蔣宏偉應(yīng)用ELISA技術(shù)，用針對(duì)兔IgG的羊抗體包被微量反應(yīng)板，對(duì)蜂蜜、豬肉、牛肉、蛋粉、奶粉、牛尿等動(dòng)物產(chǎn)品中的AOZ、AMOZ進(jìn)行了檢測(cè)。作者認(rèn)為該ELISA法采用了AOZ或AMOZ特異性抗體，精確度、靈敏度均較高，具有經(jīng)濟(jì)、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，適合于大量動(dòng)物產(chǎn)品樣本中呋喃唑酮、呋喃它酮?dú)埩袅繖z測(cè)的快速篩選。Pimpitak等建立了蝦肉中AMOZ的ELISA方法。該方法獲得了針對(duì)AMOZ的兩種高特異性單克隆抗體，其中一種僅僅針對(duì)呋喃它酮和AMOZ產(chǎn)生高特異性結(jié)合，不與其他化合物發(fā)生交叉反應(yīng)。競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法中其IC50針對(duì)AMOZ和呋喃它酮分別為5.33ng/mL、1.33ng/mL，檢測(cè)限可以達(dá)到0.16μg/kg。

王欽暉等采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法測(cè)定了豬肉中呋喃妥因代謝物AHD。在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物AHD經(jīng)衍生化后和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗呋喃妥因代謝物的衍生物抗體，加入酶標(biāo)二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物AHD代謝物的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即得出樣本中呋喃妥因代謝物的殘留量。

Vass等應(yīng)用分子模擬研究抗原的合成，獲得呋喃西林代謝物SEM的多克隆抗體，并建立直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法。得到的SEM多抗IC50為0.06～2.28μg/L，線性范圍為0.01～0.2ug/L。在0.5～20ug/kg范圍內(nèi)，方法的回收率在82%～105%之間，CV小于15.5%。在沒(méi)有假陰性結(jié)果的前提下，肌肉中方法的靈敏度可達(dá)到0.3μg/kg。Cooper等建立了雞肉中SEM的ELISA方法，與呋喃西林的交叉反應(yīng)率為1.7%，在一定范圍內(nèi)與其他呋喃類藥物幾乎不存在交叉反應(yīng)。方法CCβ為0.25μg/kg，此方法同時(shí)也可用于雞蛋和雞肝樣品中SEM的檢測(cè)。

2)膠體金免疫層析法(immune colloidal gold technique，GICT)

潘心紅等用小牛血清蛋白(BSA)偶聯(lián)的AMOZ免疫小鼠，制得雜交瘤細(xì)胞，得到純化好的抗AMOZ單克隆抗體，并制得膠體金試紙條。用膠體金試紙半定量法直接測(cè)定魚肉中呋喃它酮代謝物AMOZ的含量。結(jié)果表明，與AOZ、AHD無(wú)交叉反應(yīng)，檢測(cè)靈敏度可達(dá)2.5μg/kg，回收率在80%～91%之間，相關(guān)性良好。該方法測(cè)定的結(jié)果與HPLC法相符，無(wú)顯著性差異。

3)熒光免疫分析法(fluoroimmunoassay，F(xiàn)IA)

沈玉棟等首次建立了呋喃西林代謝物SEM的熒光偏振免疫分析(FPIA)方法。通過(guò)設(shè)計(jì)合成新的SEM半抗原CEPSEM，偶聯(lián)載體蛋白后免疫新西蘭大白兔，制備親和力高、特異性好的多克隆抗體。在示蹤物濃度為0.5nmol/L，抗體稀釋度為1/100的優(yōu)化條件下，IC50為47.9μg/L，檢出限為8.3ug/L，線性范圍為15.8～145.7μg/L。該方法特異性強(qiáng)，和其他相關(guān)善藥交叉反應(yīng)小于0.1%，穩(wěn)定性好，批內(nèi)RSD小于2.5%，批間RSD小于6.3%。

4)免疫傳感器(immunosensor)

Yang等在傳統(tǒng)的無(wú)標(biāo)記電化學(xué)阻抗滴定免疫傳感器的基礎(chǔ)上，建立了一種快速可靠的電化學(xué)方法檢測(cè)AOZ。AOZ單克隆抗體(AOZ-McAb)通過(guò)EDC和NHS所產(chǎn)生的穩(wěn)定的酰基氨基酯中間體在金電極.上包被，它可冷凝自組裝單層(SAM)上的抗體。通過(guò)電化學(xué)阻抗譜(E1S)測(cè)量AOZ和AOZ-McAb免疫反應(yīng)前后的電荷轉(zhuǎn)移電阻的相對(duì)變化而實(shí)現(xiàn)對(duì)AOZ的檢測(cè)。在優(yōu)化條件下，電荷轉(zhuǎn)移電阻的相對(duì)變化與AOZ濃度的對(duì)數(shù)值成比例，在20.0～1.0×104ng/mL(r-0.9987)之間。同時(shí)，這個(gè)免疫傳感器對(duì)AOZ具有很高的選擇性，對(duì)AMOZ、SEM和AHD沒(méi)有顯著反應(yīng)。在實(shí)際樣品的AOZ檢測(cè)中具有良好的效果。

5)生物芯片(biochip)

OMahony等將基于化學(xué)發(fā)光生物芯片陣列感測(cè)技術(shù)應(yīng)用到蜂蜜中NFs殘留篩查。通過(guò)這種復(fù)合技術(shù)，4種NFs代謝物可以被同時(shí)檢測(cè)。分別針對(duì)各代謝物的特異性抗體被點(diǎn)到生物芯片上，競(jìng)爭(zhēng)性分析通過(guò)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)展開(kāi)。該方法按照歐盟法規(guī)2002/657/EC的規(guī)定進(jìn)行了驗(yàn)證。采用相似的提取方法，即用OasisSPE提取，再用2-NBA衍生化，乙酸乙酯萃取，與UPLC-MS/MS方法進(jìn)行了比較。該生物芯片陣列感測(cè)技術(shù)可以檢測(cè)執(zhí)行限濃度(1μg/kg)下的4種代謝物，AHD、AOZ和AMOZ的檢測(cè)能力低于0.5μg/kg，SEM低于0.9μg/kg，IC50從0.14μg/kg(AMOZ)到2.19μg/kg(SEM)。這種生物芯片技術(shù)在食品安全研究領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景。

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