β-內(nèi)酰胺類藥物殘留分析技術(shù)——凈化方法（二）

時間：2023-03-25 07:24:38來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

β-內(nèi)酰胺類藥物殘留分析技術(shù)——凈化方法（二）

[db:作者] / 2022-12-09 00:00

3)基質(zhì)固相分散萃取(matrix solid-phase dispersion，MSPD)

MSPD 是一種快速樣品處理技術(shù)。其基本操作是把樣品直接與適量的反相鍵合硅膠一起混合研磨，使樣品被均勻分散于固定相顆粒表面制成半固態(tài)，裝入層析柱中，然后采用類似SPE的操作進(jìn)行洗滌和洗脫。MSPD技術(shù)使用樣品量少，要求檢測方法具有較高的靈敏度。Karageorgou等用Strata-X做吸附劑，MSPD法提取牛奶中5種PENs藥物。Strata-X吸附劑經(jīng)2mL甲醇和2mL水活化，加入牛奶樣品進(jìn)行混合，超聲波水浴中超聲10min進(jìn)行勻質(zhì)，隨后樣品轉(zhuǎn)移至一個空的貯存器進(jìn)行壓縮，真空干燥吸附劑。接著加入5mL水(含1%丙酮)淋洗吸附劑，分析物分別用1mL甲醇、1mL乙腈洗脫，蒸干，再用Oasis HLB柱凈化，HPLC檢測。方法檢測限(CCa)為35.2～56.3μg/kg，檢測能力(CCβ)為39.9～61.9μg/kg；RSD小于16%。

4)分散固相萃取(dispersive solid phase extraction，DSPE)

分散固相萃取是美國農(nóng)業(yè)部于2003年提出使用的一-種新的樣品前處理技術(shù)。該技術(shù)是選擇對不同種類藥物都具有良好溶解性能的溶液作為提取劑，凈化吸附劑直接分散于待凈化的提取液中，吸附基質(zhì)中的干擾成分。該方法回收率高，前處理時間短，溶劑使用量少，操作簡便，具有很好的發(fā)展前景和推廣價值。Mastovska等測定牛腎臟中11種β-內(nèi)酰胺類抗生素，取1g樣品至50mL離心管中，加入2mL水和8mL乙腈進(jìn)行提取，渦動混勻，劇烈晃動5min，離心收集上清液。然后在上清液中加入500mg C18吸附劑，渦動混勻，晃動30s，離心。取5mL上清液轉(zhuǎn)移至帶刻度的試管中，旋蒸至體積小于1mL，用水定容至1mL，濾膜過濾后進(jìn)LC-MS分析。除頭孢噻呋代謝物(去呋喃甲酰基頭孢噻呋)回收率低外，其他化合物的回收率均在87%～103%之間。

5)QuEChERS(Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe)

QuEChERS是近年來國際上最新發(fā)展起來的一種用于農(nóng)產(chǎn)品檢測的快速樣品前處理技術(shù)。原理與HPLC和SPE相似，都是利用吸附劑填料與基質(zhì)中的雜質(zhì)相互作用，吸附雜質(zhì)從而達(dá)到除雜凈化的目的。Karageorgou等采用基于超聲輔助MSPD方法，開發(fā)出QuEChERS技術(shù)提取與凈化牛奶中的阿莫西林、氨芐西林、苯唑西林、雙氯西林和氯唑西林。用乙腈提取后，200mgStrata-X、150mg MgSO4、50mg PSA、50mg C18作為QuEChERS凈化劑，采用HPLC進(jìn)行檢測。方法的日內(nèi)精密度低于16%，5種藥物的CCa為35.2～56.3μg/kg，CCβ為39.9～61.9μg/kg，滿足歐盟法規(guī)2002/657/EC要求。Perez-Burgos等建立了一種LC-MS/MS同時檢測牛肉中7種CEPs殘留的QuEChERS方法。樣品經(jīng)乙腈-水(80+20，v/v)提取后，采用QuEChERS方法進(jìn)行凈化。將10mL樣品提取液加入含有150mg PSA、150mg C18吸附劑和900mg MgSO4的試劑盒。然后輕輕晃動5min，3500r/min離心5min收集上清液。取5mL上清液氮氣吹干，200μL水復(fù)溶后上樣分析。結(jié)果顯示，采用傳統(tǒng)SPE方法的LOQ稍低(0.1～10μg/kg)，兩種凈化方法的LOQ均低于MRLs，但QuEChERS方法精密度高于SPE方法，兩種方法均獲得較好的回收率，除頭孢氨芐外，其他藥物回收率均高于85%。

6)分子印跡技術(shù)(molecular imprinting technology，MIT)

MIT以待測物為模板分子，通過共價鍵結(jié)合或非共價鍵結(jié)合聚合物單體，然后將聚合物單體交聯(lián)，再將模板分子從聚合物中提取出來，聚合物內(nèi)部就留下了模板分子的印跡，成為能選擇性吸附待測物的功能高分子材料-分子印跡聚合物(MIP)。Cederfur等合成了以青霉素G為模板的高選擇性MIP填料。稱取1mmoL/L青霉素G至硼硅玻璃管中，加入乙腈超聲溶解，加入甲基丙烯酸溶解青霉素G，預(yù)聚合反應(yīng)混合物放在冰上進(jìn)行冷卻，氮吹10min。然后在Rayonet光化學(xué)反應(yīng)器中，在350nm、4℃下共聚反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行離心，收集大小為25～50μm的聚合物。將顆粒物分別用甲醇-乙酸(1+4，v/v)、甲醇、乙腈和甲醇進(jìn)行孵育，然后真空干燥顆粒物。制備MIP后，合成聚合物文庫，然后從文庫中篩選與青霉素G結(jié)合的聚合物，對MIP進(jìn)行放射性配體競爭結(jié)合試驗。研究發(fā)現(xiàn)，該MIP填料與其他幾種PENs交叉反應(yīng)率小于19%，蔡夫西林和苯唑西林交叉反應(yīng)率小于1%，與頭孢匹林和其他結(jié)構(gòu)不相關(guān)的抗生素(氯霉素、四環(huán)素、氨苯砜和紅霉素)的交叉反應(yīng)率低于0.01%。Zhang等甲基丙烯酸作為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯做交聯(lián)劑，偶氮二異丁腈作為引發(fā)劑合成青霉素G的MIP填料，凈化牛奶中青霉素G。牛奶經(jīng)乳酸桿菌發(fā)酵形成酸奶，取10mL牛奶加入10mg MIP，混勻5min進(jìn)行提取，分離青霉素GMIP后，牛奶繼續(xù)進(jìn)行發(fā)酵。該方法測得青霉素G的靈敏度達(dá)10μg/kg。

7)免疫親和色譜(immunoffinity chromatography，IAC)

IAC是用色譜柱技術(shù)，把抗體固定在適當(dāng)?shù)闹С治锷希苽涑鲇糜跇悠贩蛛x純化的IAC柱，其再與色譜聯(lián)用，達(dá)到很好的分離檢測效果。利用抗體與抗原/半抗原可逆的生物專一性相互作用來達(dá)到凈化和富集分析物的目的。具有高度的選擇性和特異性，特別適用于復(fù)雜樣品基質(zhì)中痕量組分的分離和富集。將IAC作為理化測定技術(shù)的樣品凈化手段，使樣品前處理大大簡化，通常一次層析即可使待測物得到高度凈化和富集；同時，使用多種抗體制備的IAC柱(MIAC)使免疫分析具備了處理多殘留組分的能力。Dietrich等通過免疫小鼠獲得抗氨芐西林單克隆抗體。純化后的Mab1D1與CNBr活化的Sepharose 4B偶聯(lián)，制備出IAC柱。該IAC柱對氨芐西林和氯唑西林的吸附量分別為6.6μg/mL和5.4μg/mL。緩沖液中阿莫西林、氨芐西林、氯唑西林、雙氯西林、青霉素G和苯唑西林在IAC柱的回收率分別為67%～100%。陳號以青霉素類藥物母核6-氨基青霉烷酸(6-APA)偶聯(lián)牛血清蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)分別合成兩種免疫原和包被原，制備出高效價的抗6-APA的抗血清，經(jīng)活性檢測后被純化，純化的IgG偶聯(lián)CNBr活化的Sepharose4B制備IAC柱，采用HPCE方法對IAC柱柱效進(jìn)行初步評價。建立的青霉素G標(biāo)準(zhǔn)曲線在1～100μg/mL范圍內(nèi)線性良好，青霉素G樣品添加回收率為76.38%～94.67%，CV為5.67%～15.91%。

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