牛尿中a-群勃龍、β-群勃龍、19-乙烯去甲睪酮和epi-19-乙烯去甲睪酮殘留量的測定

[db:作者] / 2022-12-13 00:00

8.2.5.1 適用范圍

適用于牛尿中a-群勃龍、β-群勃龍、19-乙烯去甲睪酮和epi-19-乙烯去甲睪酮殘留量的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。方法檢出限均為2μg/L。

8.2.5.2 方法原理

試樣在pH=5.0條件下加酶水解，經(jīng)免疫親和柱凈化，用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定，外標(biāo)法定量。方法檢出限：牛尿中a-群勃龍、β-群勃龍、19-乙烯去甲睪酮和epi-19-乙烯去甲睪酮均為2μg/L。

8.2.5.3 試劑和材料

甲醇、乙腈、乙酸：色譜純；β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯(B-glucuronidase/aryl sulfatase)：100000unit/mL。

氫氧化鈉溶液：1mol/L。10g氫氧化鈉溶于250mL水中。

鹽酸溶液：1mol/L。吸取20.8mL濃鹽酸溶于水中，定容至250mL。

免疫親和柱淋洗緩沖儲備液和柱儲存緩沖儲備液：免疫親和柱附帶。

柱淋洗緩沖溶液：量取1mL儲備溶液與19mL水混溶，臨用前現(xiàn)配。

柱儲存緩沖溶液：量取1mL儲備溶液與4mL水混溶，臨用前現(xiàn)配。甲醇+水溶液(70+30，v/v)。

a-群勃龍、β-群勃龍、19-乙烯去甲睪酮和epi-19-乙烯去甲睪酮標(biāo)準物質(zhì)：純度≥98%。

標(biāo)準儲備溶液：分別精確稱取a-群勃龍、β-群勃龍、19-乙烯去甲睪酮和epi-19-乙烯去甲睪酮標(biāo)準物質(zhì)各0.0100g，用乙腈溶解并定容至100mL，配制成100μg/mL的標(biāo)準儲備溶液。此溶液-18℃冷凍保存，可使用6個月。

混合標(biāo)準工作溶液：取標(biāo)準儲備溶液各5mL至50mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成混合標(biāo)準工作溶液，濃度為10μg/mL，此溶液-18℃冷凍保存，可使用三個月。

群勃龍/19-乙烯去甲睪酮免疫親和柱：帶有柱淋洗緩沖儲備溶液和柱儲存緩沖儲備溶液，在2～8℃保存。

8.2.5.4 儀器和設(shè)備

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源(ESI)。離心機：最大轉(zhuǎn)速5000r/min。恒溫水浴搖床。旋渦混合器。氮氣濃縮儀。固相萃取裝置。

8.2.5.5 樣品前處理

(1)試樣制備

取新鮮牛尿迅速冷凍作為試樣備用。制備好的試樣置于-18℃冰柜中避光保存。

(2)試樣稱取

取5個陰性樣品，將冷凍尿液融化混勻，取部分樣品以轉(zhuǎn)速4000r/min離心10min。然后，每個樣品分別量取5mL(精確到0.01mL)于15mL具塞離心管中，再分別加入不同量混合標(biāo)準工作溶液，使各被測組分的濃度均為2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL。

(3)水解

分別將上述離心管溶液，用1mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)尿樣pH在4.9～5.1之間，接著加入40μL β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯，搖勻后蓋好塞子置于恒溫水浴搖床上37℃振蕩水解2h。待水解液冷卻至室溫后，加入4mL柱淋洗緩沖溶液，用1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)整尿樣pH在7～9之間。

(4) 免疫親和柱凈化.

首先將柱中儲存緩沖溶液過柱，再用15mL柱淋洗緩沖溶液平衡柱子。然后，將水解處理好的尿樣過柱，接著依次用8mL柱淋洗緩沖溶液、5mL水淋洗柱子。最后，用4mL甲醇+水溶液洗脫分析物并收集于帶刻度的試管中(.上述過程過柱流速應(yīng)≤2mL/min)。洗脫液用氮氣濃縮儀在60℃水浴中吹至約1mL，用流動相定容至2mL，漩渦振蕩混合，過0.45μm濾膜供HPLC-MS-MS測定。

(5)試樣溶液的制備

將冷凍尿液樣品融化混勻，取部分樣品以轉(zhuǎn)速4000r/min離心10min。然后，量取5mL(精確到0.01mL)于15mL具塞離心管中。按上述步驟操作。

(6)空白基質(zhì)溶液的制備

將陰性冷凍尿液樣品融化混勻，取部分樣品以轉(zhuǎn)速4000r/min離心10min。然后，量取5mL(精確到0.01mL)于15mL具塞離心管中。按上述步驟操作。

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