甾類同化激素類藥物殘留分析技術(shù)測定方法（五）

[db:作者] / 2022-12-13 00:00

(6)免疫分析法(immunoassay，IA)

免疫分析法實際上是一種以抗體或抗原為分析試劑的特殊分析方法。免疫分析法包括酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)、放射免疫分析法(RIA)和膠體金免疫層析分析法(GICA)，這三種方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高(可達(dá)10-12 g)、操作簡單等優(yōu)點，逐漸成為ASs殘留初篩的常用方法。然而，也存在其產(chǎn)生的分析信號反差較高、靈敏試劑弱以及假陽性結(jié)果出現(xiàn)率偏高等缺點。

1)放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)

RIA是利用被測定的抗原物質(zhì)和其標(biāo)記物(標(biāo)記抗原)同特異性抗體之間存在著競爭性的結(jié)合的放射性同位素體外微量分析方法，由于對人體具有放射性危害而較少應(yīng)用。徐美奕等應(yīng)用RIA法檢測了養(yǎng)殖與野生軍曹魚肌肉中生長激素及雌二醇、孕酮、睪酮等3種ASs的殘留量。通過預(yù)實驗確定魚肉激素提取液加入量為藥盒建議量的2倍。在放免試管中分別加入GH、E2、P、T標(biāo)準(zhǔn)抗原或待測的魚肉激素提取液、125I標(biāo)記抗原、抗體，在37℃下的溫育時間分別為2.5h、1.5h、0.5h和1h，待免疫反應(yīng)達(dá)到平衡后，4℃下離心(3600r/min)20min，棄去.上清液，用計數(shù)器分別測量各反應(yīng)管沉淀物的放射性計數(shù)(cpm)，用SPSS統(tǒng)計軟件繪制劑量反應(yīng)曲線，計算待測魚肉中的ASs殘留量。養(yǎng)殖軍曹魚中3種ASs殘留量分別為50.92×10-12、2.08×10-9、0.44×10-9，野生軍曹魚中3種ASs殘留量分別為29.78×10-12、1.28×10-9、0.08×10-9。

2)酶聯(lián)免疫分析法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)

ELISA利用抗原抗體之間專--性嵌合特性，對檢體進(jìn)行檢測。由于結(jié)合于固體承載物(一般為塑膠孔盤)上之抗原或抗體仍可具有免疫活性，因此設(shè)計其嵌合機(jī)制后，配合酵素呈色反應(yīng)，即可顯示特定抗原或抗體是否存在，并可利用呈色之深淺進(jìn)行定量分析。根據(jù)待測樣品與嵌合機(jī)制的不同，ELISA可設(shè)計出各種不同類型的檢測方式，主要以夾心法(sandwich)、間接法(indirect)以及競爭法(competitive)三種為主，具有靈敏度高、特異性好，操作簡便等特點，但是存在很難實現(xiàn)多殘留分析，存在交叉污染，容易出現(xiàn)假陽性等缺點。夾心法主要用來測大分子物質(zhì)，而獸藥作為-一種小分子物質(zhì)，夾心法很少使用。本章主要介紹間接競爭ELISA法和直接競爭ELISA法。

A.間接競爭ELISA法

Peng等建立了-種檢測豬肉中醋酸甲羥孕酮的間接競爭ELISA檢測方法。采用碳化二亞胺和混合酸酐法將藥物與牛血清白蛋白(BSA)，免疫獲得抗體。該方法LOD為0.096ng/g，可食組織的回收率范圍為72%～91%，工作濃度范圍為0.1～8.1ng/g。郭金花也開發(fā)了醋酸甲羥孕酮的ELISA試劑盒。將肟化后的醋酸甲羥孕酮分別與BSA和卵血清蛋白(OVA)通過混合酸酐法交聯(lián)，制備免疫抗原MPA-BSA和包被抗原MPA-OVA。以該免疫原免疫兔子后獲得的抗血清為基礎(chǔ)設(shè)計了間接競爭ELISA法。IC50為4.95ng/mL，線性范圍為0～100ng/mL，LOD范圍為0.1～0.3ng/mL，批內(nèi)CV小于15%，批間CV小于20%。Jiang等采用間接競爭ELISA檢測牛尿中19-去甲睪酮殘留。該方法將藥物與半抗原偶聯(lián)免疫BALB/c小鼠獲得雜交瘤細(xì)胞，獲得mAbs親和力為2.6×109～4.7×109，滴度為0.64×105～2.56×105，IC50為0.55～1.0ng/mL。樣品用10%甲醇作為稀釋液，進(jìn)行20倍稀釋。建立的間接競爭ELISA檢測方法的檢測范圍是0.004～85.8ng/mL，LOD是0.002ng/mL，IC50為0.55ng/mL。劉劍波等應(yīng)用間接競爭ELISA法測定了醋酸甲羥孕酮在動物源可食組織中的殘留量，并采用GC-MS方法加以確證。比較GC-MS確證方法與ELISA方法所得結(jié)果，兩者的檢測結(jié)果相關(guān)性良好。

B.直接競爭ELISA法

Jiang等還建立了一種檢測牛可食性組織中19-去甲睪酮的直接競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗方法(dcELISA)方法。通過細(xì)胞融合過程產(chǎn)生高特異性的單克隆抗體(mAbs)，并且建立了基于mAbs的異源性直接競爭ELISA法。方法工作濃度范圍是0.004～19ng/mL，IC50和LOD分別為0.28ng/mL、0.002ng/mL(0.01mol/L磷酸鹽緩沖液中，pH7.4)。與β-勃地酮交叉反應(yīng)率為6.9%，與群勃龍交叉反應(yīng)率為1.2%。實測樣檢測時直接競爭ELISA方法與GC-MS相關(guān)系數(shù)分別為0.9918(牛肉)、0.9834(牛肝)、0.9976(牛腎)。Sawaya等應(yīng)用直接ELISA方法檢測了羊尿液和雞肉中的雌激素含量。用GC-MS方法檢測雌激殘留，結(jié)果為陰性，為了確證其殘留限度，再用ELISA方法進(jìn)行檢測。ELISA試劑盒購自德國R-BiopharmgmbH公司。炔雌醇在尿液中含量范圍為0～0.9ppb，在雞肉組織中含量范圍為0～0.3ppb。研究發(fā)現(xiàn)，0.3ppb作為ELISA臨界點來判定樣品的陰性或陽性較為合理。所有樣品經(jīng)GC-MS確證分析都為陰性，此結(jié)果表明基質(zhì)對于ELISA檢測存在一定的影響。

3)膠體金免疫層析分析法(colloidal gold immunochromatographic assay，GICA)

GICA是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金是由氯金酸(HAuCl4)在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)分子(抗體)等的正電荷基團(tuán)形成牢固的結(jié)合。根據(jù)膠體金結(jié)合物的免疫學(xué)特性，因而廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域。GICA具有成本低，不需要特殊的儀器設(shè)備，使用方便快速，便于基層使用和現(xiàn)場使用的優(yōu)點，現(xiàn)已開始在殘留篩查中使用。

劉麗強(qiáng)研制了用于檢測19-去甲睪酮殘留的競爭性膠體金免疫層析試紙條。檢測線和質(zhì)控線分別用金標(biāo)點樣儀噴涂0.5mg/mL的19-去甲睪酮-OVA包被抗原和0.2mg/mL的羊抗兔IgG二抗。檢測添加19-去甲舉酮的豬尿樣本時，LOD為200ng/mL，通過使用Imag J 軟件對試紙條進(jìn)行定量分析，可以得到的LOD為25ng/mL。Jiang等建立了檢測牛肉和豬肉中19-去甲睪酮的膠體金免疫分析方法。采用改良碳二亞胺法合成人工抗原(見圖8-7)，免疫BALB/c小鼠獲得mAbs。膠體金試紙條在PBS中LOD為1ng/mL，牛肉和豬肉中LOD均為2ug/kg，結(jié)果可在10min內(nèi)讀出。田壯建立了膠體金快速檢測技術(shù)，確保能對19-去甲基睪酮進(jìn)行準(zhǔn)確、快速、高靈敏度的檢測。選擇用20nm左右的膠體金納米粒子標(biāo)記19-去甲睪酮抗體，標(biāo)記pH為8.6，標(biāo)記濃度為7.2ug(抗體)/mL(金)，最終LOD可達(dá)到5ng/mL。

圖8-7 采用EDC法合成19-去甲睪酮人工抗原方法

Wei等建立了炔諾酮的膠體金檢測方法。應(yīng)用了帶有氨基功能基團(tuán)的中空硅膠顆粒，可用于固定金顆粒，再連接辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗用來檢測炔諾酮抗原，LOD可以達(dá)到3.58pg/mL，重復(fù)性、穩(wěn)定性、靈敏度均較好。

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