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硝基呋喃類(lèi)代謝物最大允許殘留分析技術(shù)——測(cè)定方法(二)

時(shí)間:2023-03-25 05:40:31來(lái)源:food欄目:食品快速檢測(cè) 閱讀:

 

硝基呋喃類(lèi)代謝物最大允許殘留分析技術(shù)——測(cè)定方法(二)

[db:作者] / 2022-12-12 00:00

(3)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)

LC-MS串聯(lián)技術(shù)擁有高效的分離能力,出色的檢測(cè)靈敏度和較強(qiáng)的克服雜質(zhì)干擾能力,是目前測(cè)定NFs代謝物最主要的技術(shù)手段,而LC-MS/MS則是最常用的方法。

1)液相色譜-單級(jí)質(zhì)譜法(LC-MS)

LC-MS是將單四極桿質(zhì)譜儀作為一種檢測(cè)器與LC連接,是LC-MS儀的早期產(chǎn)品。與LC-MS/MS相比,在靈敏度和選擇性上都要相差不少,主要用在NFs及其代謝物檢測(cè)技術(shù)的早期開(kāi)發(fā)上。

1996年Horne等開(kāi)發(fā)了AOZ和AMOZ的LC-MS檢測(cè)方法。用鄰硝基苯甲醛衍生,經(jīng)LLP后,用LC-MS測(cè)定,肝臟樣品的檢測(cè)限為10μg/kg。朱堅(jiān)建立了雞肉和蝦中AOZ和AMOZ殘留量的LC-MS測(cè)定方法。樣品用酸水解,鄰氯苯甲醛衍生化,經(jīng)SPE柱凈化后,用LC-MS檢測(cè)。在電噴霧電離(ESI)正離子、選擇離子監(jiān)測(cè)(SIM)模式下,方法檢測(cè)低限為0.3×10-9數(shù)量級(jí)。林黎明等建立了雞組織及蛋中4種NFs代謝產(chǎn)物的LC-MS方法。用AMOZ-d5,AOZ-d4作內(nèi)標(biāo),經(jīng)ENSPE柱凈化,以乙腈-0.1%甲酸為流動(dòng)相,采用梯度洗脫,可在15min內(nèi)將4種代謝產(chǎn)物完全分離并進(jìn)行測(cè)定。方法回收率為85%~90%,檢出限可達(dá)0.5μg/kg。徐維海等采用LC-MS方法研究呋喃唑酮及其代謝產(chǎn)物AOZ在羅非魚(yú)體內(nèi)的殘留規(guī)律。在大氣壓化學(xué)電離源(APCI)電離模式下,呋喃唑酮及其代謝物AOZ的檢出限分別為10μg/kg和1μg/kg。

2)液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法(LC-MS/MS)

由于出色的靈敏度、選擇性,而且還能夠提供禁用藥物確證所需的結(jié)構(gòu)信息,LC-MS/MS已成為NFs代謝物檢測(cè)最常用的方法,也是大多數(shù)國(guó)家和組織認(rèn)可的方法。

A.組織樣品分析

Alexander等首次報(bào)道用LC-MS/MS同時(shí)分析動(dòng)物肌肉組織中4種NFs代謝物的方法。分析物被酸性水解,后從組織中釋放,用2-硝基苯甲醛衍生化,利用SPE凈化樣品,LC-MS/MS在ESI正離子、MRM模式下檢測(cè)。4種NFs代謝物AOZ、AMOZ、SEM、AHD的LOD分別為0.5ng/g、0.5ng/g、3.0ng/g、5.0ng/g,LOQ分別為2.5ng/g、2.5ng/g、10.0ng/g、10.0ng/g,測(cè)定響應(yīng)值的線性范圍從檢測(cè)限到800ng/g之間。彭濤等也率先在國(guó)內(nèi)報(bào)道了用LC-MS/MS測(cè)定動(dòng)物組織中NFs代謝物的方法。鹽酸水解組織中蛋白結(jié)合代謝物,同時(shí)加入2-硝基苯甲醛,37℃過(guò)夜衍生。上清液調(diào)pH7.0后,用OasisHLB柱凈化。采用ESI電離,正離子,選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)模式檢測(cè)。三離子原則,外標(biāo)法定量。LOQ為AMOZ、AOZ 0.1ng/g,SEM、AHD 0.5ng/g;LOD為AMOZ、AOZ 0.05ng/g,SEM、AHD 0.1ng/g,低于歐盟規(guī)定的1μg/kg的方法靈敏度要求。在添加濃度0.5~10ng/g范圍內(nèi),AMOZ回收率為65.4%~91.3%,SEM回收率為62.7%~94.6%,AHD回收率為63.9%~89.4%,AOZ回收率為67.8%~90.9%,RSD均小于4.8%。龐國(guó)芳等建立了用LC-MS/MS測(cè)定禽肉組織中AOZ、AMOZ、SEM和AHD4種NFs代謝物的方法。0.2mol/L鹽酸水解禽肉組織中與蛋白結(jié)合的NFs代謝物,用2-硝基苯甲醛37℃衍生16h。上清液調(diào)pH7.4后,用LiChrolutEN柱凈化,乙酸乙酯洗脫,流動(dòng)相定容。采用ESI電離,正離子掃描,MRM模式檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)曲線用空白禽肉樣品添加標(biāo)準(zhǔn)與樣品同步操作獲得,并用其進(jìn)行外標(biāo)定量。在添加濃度0.5~10μg/kg范圍內(nèi),4種代謝物的平均回收率在70.2%~89.1%之間;LOD為AMOZ、AOZ0.1 μg/kg,SEM、AHD0.2μg/kg;4種代謝物L(fēng)OQ均為0.5μg/kg;10次測(cè)定結(jié)果RSD在5.59%~10.10%之間。Verdon等采用LC-MS/MS方法,測(cè)定了火雞肌肉中的5種NFs(呋喃西林、呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、硝呋柳肼)的代謝產(chǎn)物SEM、AOZ、AMOZ、AHD、DNSAH。將水解、衍生的過(guò)程從37℃ 16h縮短至55℃ 4h,結(jié)果表明對(duì)測(cè)定并無(wú)顯著影響。采用乙酸乙酯提取,內(nèi)標(biāo)法定量,由于DNSAH暫無(wú)同位素內(nèi)標(biāo),采用由另一化合物硝呋酚酰肼得到的水楊酸肼作為內(nèi)標(biāo)校正。該方法同樣適用于其他家禽肌肉、蜂蜜、雞蛋和豬組織,LOQ均低于0.5μg/kg。Bock等驗(yàn)證了檢測(cè)雞肉和蝦肉中的4種NFs代謝物的確證方法,并進(jìn)行了不確定度評(píng)價(jià)。方法用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的代謝物進(jìn)行內(nèi)標(biāo)法定量,不同的樣品基質(zhì)以及樣品狀態(tài)(新鮮或者凍干樣品)均會(huì)導(dǎo)致內(nèi)標(biāo)的回收率發(fā)生變化,從而影響方法的準(zhǔn)確度,因此需要同時(shí)應(yīng)用內(nèi)標(biāo)和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線才能實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量。在穩(wěn)定性試驗(yàn)中,樣品可以在-25℃下保存12個(gè)月。方法的CCa為0.1~0.7μg/kg,CCβ為0.1~0.9μg/kg,CV在7%~17%之間。趙善倉(cāng)等開(kāi)發(fā)了畜產(chǎn)品中4種NFs代謝物殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)快速檢測(cè)方法。樣品經(jīng)衍生化后,用乙酸乙酯提取,正己烷凈化,流動(dòng)相定容。采用ESI電離,正離子掃描,MRM方式采集數(shù)據(jù),外標(biāo)法定量。在添加濃度為0.1~2.0ug/kg范圍內(nèi),4種代謝物的平均回收率在67.3%~85.0%之間,10次測(cè)定結(jié)果的CV在2.0%~9.7%之間;最低檢出限均達(dá)到0.15μg/kg;在0.1~20.0ng/mL的線性范圍內(nèi),相關(guān)系數(shù)r均大于0.99。實(shí)現(xiàn)了樣品檢測(cè)的快速和高靈敏,適用于豬肉和豬肝中NFs代謝物的殘留檢測(cè)。劉紅衛(wèi)等采用UPLC-MS/MS,ESI電離,正離子模式,對(duì)腸衣中4種NFs代謝物殘留量進(jìn)行定性定量檢測(cè)。用甲醇、水脫脂去除部分雜質(zhì),經(jīng)OasisHLB小柱富集凈化后,用Waters ACQUITY UPLC TM BEH C18色譜柱分離,以0.3%乙酸乙腈溶液和0.3%乙酸溶液為流動(dòng)相,梯度洗脫。在MRM模式下以保留時(shí)間和離子對(duì)(母離子和兩個(gè)子離子)信息比較進(jìn)行定性,以響應(yīng)值高的子離子進(jìn)行定量。該法的檢出限為0.2~0.5μg/kg,加標(biāo)回收率為86%~97%,RSD小于10%。

B.蜂產(chǎn)品分析

丁濤等報(bào)道了LC-MS/MS測(cè)定蜂王漿中呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃它酮4種NFs代謝物殘留的方法。以三氯乙酸作為蜂王漿的蛋白質(zhì)沉淀劑,同時(shí)提供衍生化反應(yīng)所需的酸性環(huán)境;使用4種同位素內(nèi)標(biāo),補(bǔ)償了衍生化效率、衍生后樣品溶液的pH及光照對(duì)定量結(jié)果所產(chǎn)生的影響,極大地提高了定量的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,呋喃它酮代謝物的LOD可以達(dá)到0.03μg/kg,其他3種代謝物可以達(dá)到0.05μg/kg(S/N大于5);呋喃它酮代謝物的LOQ可以達(dá)到0.20μg/kg,其他3種代謝物可以達(dá)到0.25μg/kg(S/N大于10);線性范圍為0.4~20ng/mL,添加回收率為97.7%~104.8%(內(nèi)標(biāo)校正),RSD為2.7%~9.7%。Khong等建立了檢測(cè)蜂蜜中NFs代謝物的同位素稀釋LC-MS/MS方法。HPLC分析柱為反相C18柱(150mm×2.1mm,3.5μm),流動(dòng)相為水(含0.025%的乙酸)和乙腈,采取線性梯度洗脫的方式,流速為0.3mL/min,分析物在正離子模式進(jìn)行分析,ESI源,源溫為300℃,毛細(xì)管電壓為5.5kV,掃描模式為MRM。氘代化的NFs代謝物隨樣品一起衍生化,以?xún)?nèi)標(biāo)法進(jìn)行準(zhǔn)確定量。NFs的檢測(cè)靈敏度達(dá)到1.0μg/kg,在此濃度進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn),回收率為82%~112%。AHD、AMOZ、AOZ、SEM的CCa分別為0.46μg/kg、0.07μg/kg、0.12μg/kg、0.36ug/kg,CCβ分別為0.56μg/kg、0.12μg/kg、0.18μg/kg、0.43μg/kg。在篩查市場(chǎng)上蜂蜜的用藥情況時(shí),100多個(gè)蜂蜜樣品中的14%含有AOZ,21%含有SEM。余建新等采用微量化樣品前處理技術(shù),以鄰硝基苯甲醛為衍生劑,ESI正離子、MRM方式建立了蜂蜜中4種NFs代謝物殘留量同時(shí)測(cè)定的LC-MS/MS方法。方法的檢出限為0.02~0.3ng/g,線性范圍均大于102,線性方程的相關(guān)系數(shù)r大于0.997,回收率為79.0%~95.6%。

C.乳、蛋分析

彭濤等用LC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定奶粉中呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因的代謝物。鹽酸水解奶粉中蛋白結(jié)合的代謝物,同時(shí)加入2-硝基苯甲醛,37℃過(guò)夜衍生化。加入硫酸鋅,調(diào)pH7.0后,再加入亞鐵氰化鉀去除蛋白。然后用乙酸乙酯提取,正已烷凈化,分析物采用ESI正離子、MRM模式檢測(cè),內(nèi)標(biāo)法定量。在添加濃度0.5~2μg/kg范圍內(nèi),內(nèi)標(biāo)法回收率為89.5%~110.3%;RSD小于11.3%。AMOZ、AOZ的LOD為0.05μg/kg,SEM、AHD為0.1μg/kg。Chu等應(yīng)用LC-MS/MS方法檢測(cè)了牛奶中的NFs代謝物的殘留量。液相色譜的流動(dòng)相為甲醇和20mmol/L乙酸銨,串聯(lián)質(zhì)譜在APCI正離子模式下,應(yīng)用MRM進(jìn)行采集數(shù)據(jù)。每個(gè)監(jiān)測(cè)離子對(duì)的駐留時(shí)間為150ms,離子源溫度為350℃,離子噴霧電壓為5.5kV。此方法中4種藥物的回收率為83%~104%,CV均小于13%;AOZ、SEM、AHD和AMOZ的LOD分別為0.1ng/g、0.2ng/g、0.2ng/g、0.1ng/g,LOQ為0.2ng/g。

曹文卿等建立了蛋黃粉中呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮等NFs代謝物殘留的LC-MS/MS測(cè)定方法。利用硅藻土為基質(zhì)分散劑對(duì)蛋黃粉進(jìn)行基質(zhì)分散,三氯乙酸溶液沉淀蛋白并提供水解環(huán)境,2-硝基苯甲醛衍生化,乙酸乙酯液液萃取等前處理手段對(duì)蛋黃粉中的硝基呋喃代謝產(chǎn)物進(jìn)行了提取和凈化,LC-MS/MS檢測(cè)。方法測(cè)定低限為0.5μg/kg,線性范圍為0.5~6.0μg/kg,室內(nèi)驗(yàn)證回收率范圍為90.06%~109.8%,RSD為2.0%~7.7%。Bock等建立了雞蛋中NFs代謝物的LC-MS/MS方法,并進(jìn)行了驗(yàn)證。AHD和SEM的CCa和CCβ均在0.2μg/kg左右,AMOZ的CCa和CCβ在0.05μg/kg左右,AOZ的CCa和CCβ低于0.05μg/kg。

D.血漿、血清分析

Radovnikovic等建立了UHPLC-MS/MS方法用于動(dòng)物血漿中(牛、羊、馬和豬)的4種NFs代謝物(AHD、AOZ、SEM、AMOZ)的確證檢測(cè)。血漿樣品用2-硝基苯甲醛衍生化,隨后用有機(jī)溶劑萃取,萃取液濃縮,然后通過(guò)UHPLC-MS/MS分析。該方法根據(jù)歐盟委員會(huì)決議2002/657/EC進(jìn)行了驗(yàn)證。AHD、AOZ、SEM和AMOZ的回收率分別為72%、74%、57%和71%;CCa分別為0.070μg/kg、0.059μg/kg、0.071μg/kg和0.054μg/kg。這種方法可作為農(nóng)場(chǎng)獸藥監(jiān)控制的替代方法。Tai等應(yīng)用LC-MS/MS測(cè)定了畜牧場(chǎng)及肉品市場(chǎng)豬血清中4種NFs藥物代謝物殘留。樣品通過(guò)水解蛋白質(zhì)鍵合的藥物代謝物,并與2-硝基苯甲醛衍生化,通過(guò)乙酸乙酯LLP進(jìn)行凈化,然后將乙酸乙酯層用氮?dú)饬髡舭l(fā)至干,將殘余物重新溶解于50%甲醇溶液,0.22um過(guò)濾器過(guò)濾后,采用ZORBAX eclipse XDB-C18柱分離,ESI正離子模式電離,在MRM模式下進(jìn)行LC-MS/MS分析。方法LOQ為0.2ppb;SEM、AOZ、AHD和AMOZ的回收率分別為75.0%~97.6%、90.0%~92.6%、92.0%~84.4%和94.0%~94.2%,其標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.06、0.04、0.06和0.05;對(duì)950個(gè)樣品進(jìn)行了檢測(cè),其中2例樣品中AOZ和AH和呈陽(yáng)性,其測(cè)定的濃度范圍為2.5~19.4ppb。

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