硝基咪唑類藥物測(cè)定方法——免疫分析法

時(shí)間：2023-03-24 23:05:00來源：food欄目：食品快速檢測(cè) 閱讀：

硝基咪唑類藥物測(cè)定方法——免疫分析法

[db:作者] / 2022-12-21 00:00

(7)免疫分析法(immuno analysis，IA)

免疫學(xué)檢測(cè)方法是基于抗原_抗體反應(yīng)原理設(shè)計(jì)的測(cè)定藥物殘留的分析方法。免疫分析不需要復(fù)雜儀器設(shè)備，降低了檢測(cè)成本，且靈敏度高，操作簡(jiǎn)便快速。目前，硝基咪唑類藥物殘留分析中采用較多的免疫方法主要有酶聯(lián)免疫分析方法和免疫傳感器方法。

1)酶聯(lián)免疫分析法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)

ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化以及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性，讓抗體與酶復(fù)合物結(jié)合，然后通過顯色來檢測(cè)。

MNZ是一種小分子，本身并不具備免疫原性，必須將其與具有免疫原性的載體蛋白相偶聯(lián)生成完全抗原才具有免疫原性。由于MNZ本身沒有氨基、羥基或羧基等活性基團(tuán)，需要進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造。Wang等測(cè)定動(dòng)物源食品中硝基咪唑類藥物，首先在堿性條件下將RNZ的2位酯鍵水解生成MNZOH，MNZOH與戊二醛合成MNZ半抗原，分別采用混合酸酐法將半抗原與小牛血清蛋白(BSA)反應(yīng)生成包被抗原，用碳二亞胺法(EDC)將半抗原與血藍(lán)蛋白反應(yīng)生成免疫抗原，獲得了硝基咪唑類藥物的單克隆抗體，用間接顯色ELISA法檢測(cè)硝基咪唑抗體。方法的IC50分別為0.20ng/mL(MNZ)、4.0ng/mL(TNZ)、0.17ng/mL(DMZ)和0.24ng/mL(ORZ)，與MNZ、TNZ、DMZ、RNZ、ORZ和SNZ的交叉反應(yīng)率分別為100%、5%、121%、82%、16%和20%，與其他結(jié)構(gòu)或功能相似的藥物交叉率很小。在食品中的LOD為0.1ng/mL，檢測(cè)雞肉、雞肝和蝦肉中硝基咪唑類藥物的回收率為74.0%～90.6%，CV小于14%。

也可以將硝基還原為氨基后再與蛋白偶聯(lián)。Huet等用水合肼法將MNZ硝基還原成氨基，再用EDC法合成抗原，以避免載體蛋白自身的氨基和羧基在交聯(lián)劑作用下發(fā)生自身交聯(lián)，從而最大限度地減少反應(yīng)副產(chǎn)物的生成。免疫過程中，在合成抗原的誘導(dǎo)下，機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)載體BSA決定簇和半抗原決定簇的抗體。以此建立了檢測(cè)禽蛋和雞肉中MNZ、DMZ、RNZ、IPZ以及MNZOH等5種硝基咪唑類藥物的ELISA法。樣品用乙腈萃取，正己烷除脂后，ELISA檢測(cè)。不同藥物回收率在18%～98%之間；蛋和雞肉中DMZ的LOD分別小于1μg/kg和2μg/kg，MNZ的LOD小于10μg/kg，RNZ和HMMNI的LOD均小于20μg/kg，而IPZ的LOD小于40μg/kg。

2)免疫傳感器(bioimmunosensor)

免疫傳感器由偶聯(lián)抗原/抗體分子的生物敏感膜與信號(hào)轉(zhuǎn)換器組成的，將抗原抗體特異性免疫反應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)化為其他信號(hào)再進(jìn)行檢測(cè)。硝基咪唑類藥物檢測(cè)主要采用光學(xué)免疫傳感器，光學(xué)免疫傳感器使用光敏元件作為信息轉(zhuǎn)換器。將涂有抗體的光纖浸入溶液中來檢測(cè)溶液里的抗原，溶液中抗原與抗體結(jié)合，再將結(jié)合了抗體的光纖浸入含有被熒光標(biāo)記的抗原溶液里，帶有熒光指示劑的抗原會(huì)與競(jìng)爭(zhēng)抗體結(jié)合，在光纖的另一端加上光源，將返回一個(gè)熒光信號(hào)。待測(cè)試抗體的濃度越高，就有更多的熒光標(biāo)記抗原與其結(jié)合，返回的熒光信號(hào)就越強(qiáng)。Thompson等研制了檢測(cè)動(dòng)物肝臟、腎臟、禽蛋、牛奶和血清中硝基咪唑類藥物的光纖免疫傳感器。通過免疫綿羊MNZ蛋白結(jié)合物獲取多克隆抗體，交叉反應(yīng)表明所獲得的多克隆抗體可以結(jié)合至少7種主要硝基咪唑及其代謝物(包括RNZ、IPZ、MNZ、MNZOH、HMMNI和IPZOH)，樣品用乙腈提取離心后直接測(cè)定。DMZ的CCβ小于1μg/kg或mg/L。Connolly等也利用硝基咪唑多克隆抗體，制備了可同時(shí)測(cè)定禽肉中DMZ、MNZ、RNZ、MNZOH和HMMNI的光纖生物傳感器。DMZ、MNZ和RNZ的CCβ小于1ppb，另外兩種代謝物的CCβ小于2ppb。

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