苯并咪唑類藥物測定——高效液相色譜法

時間：2023-03-24 23:08:18來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

苯并咪唑類藥物測定——高效液相色譜法

[db:作者] / 2022-12-21 00:00

(3)高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)

BMZs及其代謝物理化性質(zhì)不同，HPLC同時分離多種BMZs有一定的困難，需要解決包括分辨率、峰形、峰銳度和合理運行時間等一系列問題。BMZs殘留檢測的HPLC方法主要采用反相色譜柱(C8或C18)、硅膠柱或陽離子交換柱，使用醋酸銨緩沖液-乙腈-甲醇混合液等作為流動相體系。BMZs有強的紫外發(fā)色團(tuán)，適用于UVD檢測；ABZ、FLU、TBZ及其代謝物還有熒光發(fā)色團(tuán)，適于進(jìn)行高靈敏和高選擇性的FLD檢測。Le Boulaire等測定組織中TBZ、MBZ時，發(fā)現(xiàn)TBZ熒光信號比紫外信號靈敏20倍，但是其余BMZs不具有天然熒光發(fā)色團(tuán)，因此FLD不如UVD應(yīng)用廣泛。

1)紫外檢測器(ultraviolet detector，UVD)

A.組織

張素霞等建立了牛肝中3種BMZs的HPLC法。牛肝組織樣品經(jīng)乙酸乙酯提取，正己烷除脂，然后C18 SPE凈化，甲醇-磷酸二氫銨緩沖液(60+40，v/v)為流動相，C18柱分離，UVD檢測，檢測波長為295nm。牛肝中4個添加水平的平均回收率為78.8%，平均CV為2.18%，3種藥物的LOD為8μg/kg，LOQ為25μg/kg。Danaher等用UVD在298nm檢測了肝組織中14種BMZs殘留。用未修飾的超臨界CO2從添加樣品中提取BMZs，用中性氧化鋁柱和SCX柱凈化提取物，再用HPLC-UVD檢測。用C18色譜柱分離，流動相為pH6.8磷酸二氫銨-甲醇-乙腈混合液梯度洗脫。除TBZ、CAM和TCB-SO2不能定量外，其余11種BMZs的平均回收率在51%～113%之間，LOD為50μg/kg，日內(nèi)及日間CV分別小于10%和32%。Rose等用乙腈提取肝組織中9種OFZ代謝物，經(jīng)乙酸處理后，過SCX柱凈化，HPLC-UVD測定。用C8柱分離，0.1mol/L碳酸銨-甲醇(80+20，v/v)和0.1mol/L碳酸銨-甲醇(20+80，v/v)為流動相，梯度洗脫，運行時間少于35min，檢測波長為290nm。藥物回收率在28%～117%之間，F(xiàn)BZ、OFZ、TBZ、TBZ-5-OH的LOD為5μg/kg。陳毓芳等建立了同時測定動物腎臟中OFZ、CAM、ABZ及FBZ等4種BMZs殘留量的反相HPLC方法。色譜柱為DiscoveryC18柱，甲醇-0.02mol/L pH7.0磷酸二氫鉀緩沖液(65+35，v/v)為流動相，等度或梯度洗脫，紫外二極管陣列檢測器(PDA)檢測，檢測波長為294nm和316nm。方法LOD為0.01mg/kg；相關(guān)系數(shù)大于0.9999；在0.05～10.0mg/L的范圍內(nèi)的添加回收率為74.8%～90.25%，精密度為2.1%～7.3%。

杜紅鴿等建立了動物肌肉組織中ABZ及其代謝物ABZ-SO、ABZ-SO2的HPLC分析方法。用乙酸乙酯提取肌肉組織樣品中的藥物，提取液濃縮后用酸性乙醇復(fù)溶，正已烷除脂，過HLB柱凈化，以水-乙腈-0.1%甲酸為流動相，梯度洗脫，C18柱分離，UVD檢測，檢測波長為291nm。肌肉樣品中平均回收率為86.4%，平均CV為1.96%，3種藥物的LOD均為5ug/kg，LOQ均為20ug/kg。Hajee等在波長289nm檢測了鰻魚肌肉中MBZ、MBZ-NH2和MBZ-OH殘留。用pH7.5的乙酸乙酯提取肌肉組織中的藥物，加正已烷凈化，再過氨丙基SPE柱，濃縮定容后，HPLC分析。用ChromSpher BLC柱分離，流動相為pH6.2的磷酸鹽緩沖液-乙腈(7+3，v/v)，等度洗脫分析。該方法對MBZ-OH的LOD和LOQ分別為0.7μg/kg和1.1μg/kg，對MBZ分別為1.4μg/kg和2.3μg/kg，對MBZ-NH2分別為1.5μg/kg和2.1μg/kg；日間和日內(nèi)CV均小于5.8%；MBZ、MBZ-NH2和MBZ-OH的平均回收率分別為90%、74%和92%。嚴(yán)寒等建立了豬肉中7種BMZs殘留的HPLC方法。采用堿性乙酸乙酯提取，提取濃縮后用正已烷脫脂，經(jīng)HLB柱凈化，以乙腈-乙酸銨緩沖液為流動相，用ZORBAXEclipse Plus C18柱分離，進(jìn)行梯度洗脫，UVD檢測。該方法的平均回收率為60.3%～104.5%，LOD為7～12μg/kg。孫作剛等174采用HPLC-UVD測定羊肌肉組織中三氯苯唑及代謝物。用C18色譜柱分離，0.2mol/L乙酸銨溶液-乙腈(40+60，v/v)為流動相，檢測波長296nm。三氯苯唑酮回收率大于78.3%，批內(nèi)RSD小于4.6%；三氯苯唑回收率大于73.7%，批內(nèi)RSD小于3.8%。

B.體液

Karlaganis等用pH11的氯仿提取血漿中的MBZ及內(nèi)標(biāo)物環(huán)苯達(dá)唑，HPLC測定時采用LiChrosorb SI60硅膠色譜柱分離，乙腈-飽和氯仿水溶液-甲酸(75+92.5+0.25，v/v)為流動相，等度洗脫，307nm波長處檢測。MBZ及環(huán)苯達(dá)唑的回收率在70%-83%之間，MBZ在20～200ng/mL濃度范圍內(nèi)再現(xiàn)性的CV在3%～10%之間。Alvinerie等直接用乙酸乙酯提取血漿中的TCB、TCB-SO和TCB-SO2，離心，氮氣吹干，復(fù)溶后供HPLC分析。色譜柱為硅膠柱，正己烷-乙醇-冰醋酸(500+50+0.6，v/v)為流動相，運行時間15min，UVD檢測波長為215nm。三種化合物的回收率分別為89.5%、83.1%和82.2%，RSD分別為3.1%、3.5%和4.9%，方法的LOD為50ng/mL。Allan等用酸直接稀釋血漿，過C18 SPE柱凈化后，HPLC檢測。色譜柱為LiChrosorb RP-8 C18反相柱，以甲醇-蒸餾水(55+45，v/v)和甲醇-0.05mol/L pH5.5磷酸銨溶液(55+45，v/v)為流動相，等度或梯度洗脫，UVD檢測，檢測波長254nm。MBZ及其主要代謝物的回收率大于80%，MBZ的LOD在等度洗脫時為20ng/mL，梯度洗脫時為10ng/mL。

Bogan等建立了一種測定體液中8種BMZs的HPLC-UVD方法。用磷酸緩沖液調(diào)節(jié)血漿pH7.4，再用乙醚提取，提取液在氮氣下吹干后用甲醇復(fù)溶，HPLC測定。色譜柱為0DS-Hypersil C18柱，流動相為甲醇-碳酸銨混合液(65+35，v/v)，等度洗脫，運行時間為14min，檢測波長為292nm。血漿和胃腸液中藥物的LOD為20ng/mL，F(xiàn)BZ、OFZ和ABZ的平均回收率在70%～112%之間。Negro等建立了采用離子對色譜分離血漿和尿中TCB-SO和TCB-SO2的方法。采用蛋白沉淀和超濾方式從血清和尿樣中提取TCB-SO和TCB-SO2后，注入C18色譜柱，流動相為pH7.0 的0.05mol/L磷酸緩沖液-乙腈(55+45，v/v)，再加入0.001mol/L癸烷磺酸鈉，等度洗脫，UVD檢測波長為312nm。TCB-SO和TCB-SO2在血清中的回收率分別為91.7%和91.6%，尿樣中的回收率分別為90.3%和90.2%，兩種代謝物在血清和尿樣中的LOD均為10ng/mL。作者還對pH、有機試劑含量、直鏈烷基磺酸鈉鏈長、離子對試劑對色譜的影響等進(jìn)行了研究。

C.牛奶

De Ruyck等建立了牛奶中FBZ、TBZ、ABZ、OXI等藥物的離子對HPLC方法。奶樣中加入乙腈和乙酸乙酯后，用異辛烷除脂，再通過二氯甲烷LLP凈化，HPLC測定。色譜柱為C18柱，0.01mol/L正辛烷磺酸鈉正磷酸緩沖液(pH3.5)-乙腈-水為流動相，梯度洗脫，UVD檢測，檢測波長為295nm。方法平均回收率在68%～85%之間，LOD小于3.8ng/mL，LOQ小于6.9ng/mL，日內(nèi)和日間CV小于12.7%。Macri等建立了牛奶中8種BMZs的HPLC-UVD殘留分析方法。色譜柱為RP C18柱，流動相含有0.01mol/L戊烷磺酸鹽和5%三乙胺(pH3.5)。方法LOD為10ug/L，回收率在63.4%±5%至97.0%±3%之間。Tai等采用HPLC雙波長法測定了奶中FBZ、OFZ、TBZ和TBZ-5-OH殘留。流動相為甲醇-pH7.0的磷酸銨緩沖液，TBZ和TBZ-5-OH采用Lichrosorb RP-18色譜柱(25cm×4.6mm，10μm)分離，流動相比例為(70+30，v/v)；FBZ和OFZ采用Hypersil ODS色譜柱(25cm×4.6mm，5μm)分離，流動相比例為(53+47，v/v)或Lichrosorb RP-18色譜柱分離，流動相比例為(40+60，v/v)，流速1.0mL/min。FBZ和OFZ在298nm波長處檢測，TBZ和TBZ-5-OH在318nm波長處檢測。FBZ、OFZ和TBZ在10ug/L添加濃度水平下的回收率大于等于80%，試驗室內(nèi)CV小于等于11%。Fletouris等建立了一種簡單、快速、靈敏的HPLC方法定量追蹤分析牛奶中10種BMZs。樣品在堿性條件下用乙酸乙酯萃取蒸干，流動相再溶解，反相色譜分析。色譜柱為C18柱，流動相為含5mmo/L四丁銨的乙腈-0.01mol/L磷酸溶液(20+80，v/v)，等度洗脫，UVD檢測，檢測波長為292nm。在5.3～200μg/L濃度范圍內(nèi)，線性良好；除FBZ的LOD為40μg/L外，其他9種藥物均小于10μg/L；平均回收率為79%～100%，RSD為2.0%～5.8%。

D.雞蛋

Kan等建立了測定雞蛋中FLU及其代謝物的HPLC-UVD方法。用0.1mol/L pH9.3的硼砂溶液溶解樣品，乙酸乙酯提取三次，在蛋黃樣品提取液中再加1g硫酸鈉以減少乳化，60℃條件下，氮氣吹干有機相，殘渣用流動相復(fù)溶，再用異辛烷脫脂，過膜后，進(jìn)HPLC分析。色譜柱為Purosphere RP-18柱，pH5.2醋酸銨緩沖液-乙腈(72+28，v/v)為流動相，等度洗脫，UVD檢測，檢測波長為250nm。雞蛋中FLU的LOD為0.012mg/kg，其水解代謝物(FLU-HMET)的LOD為0.007mg/kg，降解代謝物(FLU-RMET)的LOD為0.028mg/kg；蛋白和蛋清中FLU及其代謝物的平均回收率均大于77.7%，RSD均低于10%。

2)熒光檢測器(fluorescence detector，F(xiàn)LD)

A.組織

Shaikh等建立了選擇性的HPLC-FLD方法，檢測三文魚、羅非魚和鱒魚肌肉組織的ABZ殘留標(biāo)示物。樣品處理不需要SPE凈化，直接HPLC分析。色譜柱為反相LunaC18柱，乙腈-甲醇-緩沖液為流動相，梯度洗脫，激發(fā)波長290nm，發(fā)射波長330nm。ABZ、ABZ-SO、ABZ-SO2和ABZ-NH2-SO2的LOQ分別為20μg/kg、1.5μg/kg、0.5μg/kg和5μg/kg，LOD分別為6μg/kg、1μg/kg、0.1μg/kg和2μg/kg，回收率分別大于82%、78%、75%和63%。Wilson等建立了綿羊、牛和豬的肝臟和肌肉組織中8種BMZs的HPLC-FLD分析方法。液相色譜分離柱為Whatman Partisphere C18(12.5cm×4.6mm，5um)，流動相為含有10mmol/L三乙胺的甲醇-NH4H2PO4緩沖液(53+47，v/v)，流速0.75mL/min，檢測波長298nm，進(jìn)樣量20uL。8種BMZs的LOD均為50ug/kg；在100μg/kg的添加水平下，肝臟組織的平均回收率為92%，CV為8%，肌肉組織的平均回收率為88%，CV為5%。采用FLD檢測時，可以大大減少干擾，簡化凈化環(huán)節(jié)，提高方法的回收率和重現(xiàn)性。

B.牛奶

Kinabo等建立了檢測牛奶中TCB及其代謝物的HPLC-FLD方法。用丙酮提取奶樣中的藥物，提取液用等量水稀釋后，過C18 Sep-Pak SPE柱凈化，甲醇洗脫，HPLC測定。分析柱為ODS-Hypersil柱(10cm×5mm，5μm)，流動相為0.13mol/L pH6.7醋酸銨緩沖液-甲醇(30+70，v/v)，等度洗脫，流速1.5mL/min，F(xiàn)LD檢測，激發(fā)波長300nm，發(fā)射波長676nm。對TCB-SO2、TCB-SO和TCB的LOD分別為20μg/L、40ug/L和40μg/L，回收率在76%～92%之間。Arenas等測定牛奶中的TBZ和TBZ-5-OH，將5mL奶樣用濃鹽酸在85～90℃酸解4h，釋放出與硫酸鹽結(jié)合的TBZ-5-OH，酸解物用NaOH調(diào)節(jié)pH8.0，然后用乙酸乙酯提取，提取物用PRS陽離子交換柱凈化后，HPLC分析。色譜柱為PartiSphere SCX陽離子交換柱，流動相為0.05mol/L KH2PO4-ACN (20+80，v/v)，用磷酸調(diào)pH至3.8，等度洗脫，F(xiàn)LD檢測，激發(fā)波長為308nm，發(fā)射波長為345nm。TBZ、TBZ-5-OH和與硫酸鹽結(jié)合的TBZ-5-OH回收率分別大于87%、98%和96%，CV小于等于61%，LOQ為0.05μg/mL。

3)UVD與FLD串聯(lián)

Su等建立了測定肌肉和肝臟組織中6種BMZs殘留的UVD和FLD串聯(lián)分析方法。研究發(fā)現(xiàn)290nm波長適合測定ABZ-SO、ABZ-SO2、ABZ-NH2-SO2和TBZ，而TBZ-5-OH和MBZ更適合在320nm波長處檢測；FLD檢測法(激發(fā)波長290nm，發(fā)射波長320nm)適合測定ABZ-SO、ABZ-SO2、ABZ-NH2-SO2和TBZ，而TBZ-5-OH和MBZ不適合用FLD檢測。該方法用pH10的乙腈提取肌肉和肝臟組織中的藥物，加入BHT防止TBZ-5-OH氧化，提取物用C18柱凈化，HPLC測定。分析柱為Cosmosil 5C18-MS-II柱，流動相為乙腈和0.02mol/L磷酸二氫鈉(pH3.3)，梯度洗脫。UVD的LOD在0.005～0.03μg/mL之間，F(xiàn)LD在0.004～0.02μg/mL之間；回收率在71%～101%之間，日內(nèi)和日間CV分別為1.92%和7.22%。Rummel等報道了用HPLC測定小鼠血漿中ABZ、ABZ-SO、ABZ-SO2、FBZ、FBZ-SO和FBZ-SO2的方法。小鼠血漿用碳酸鉀使其呈堿性，再用乙酸乙酯萃取，將萃取液蒸發(fā)，重新溶解在流動相中，用反相HPLC分析，乙腈-甲醇-緩沖液作為流動相。FBZ及其代謝物用UVD在290nm下進(jìn)行檢測，ABZ及其代謝物用FLD在激發(fā)波長290nm和發(fā)射波長330nm檢測。ABZ、ABZ-SO和ABZ-SO2的回收率分別為95%、82%和92%，F(xiàn)BZ、FBZ-SO和FBZ-SO2的回收率分別為64%、90%和94%，平均CV小于等于15%。

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