蜂王漿及凍干粉中9種硝基咪唑類藥物殘留量測定分析條件的選擇

時間：2023-03-24 23:20:08來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

蜂王漿及凍干粉中9種硝基咪唑類藥物殘留量測定分析條件的選擇

[db:作者] / 2022-12-21 00:00

16.2.3.7 分析條件的選擇

(1)色譜分離條件研究

1)色譜柱的選擇

本方法選擇了Waters公司的Sunfire-dC18柱(φ4.6 mm×250 mm； 5 um)和資生堂公司的UG120(φ4.6mm×250mm；5um)和MG-II C18柱(中4.6 mm×250 mm； 5 um)等色譜柱進行了比較。前者Sunfire-dC18柱對于多數堿性化合物保留都比較合適，pH適用范圍廣，在相同的流動相設置條件下，Waters Sunfire-dC18柱(φ4.6 mm× 250 mm； 5 um)的保留時間、響應峰的尖銳程度(信噪比S/N)以及分離度相對更優異、適合。

2)流動相的選擇與優化

LC-MS/MS實驗的流動相一般是甲酸、乙酸水溶液以及乙酸銨(揮發性鹽)或者低濃度的乙酸銨鹽溶液、乙酸-乙酸銨離子對緩沖鹽(需要時調節pH)等。對于多數正離子模式下的分析，按照實驗工作和儀器工程師經驗推薦，一般需要少量的酸[H]+離子，利于正離子化和[M+H]+準分子離子峰的生成電噴霧電離離子源(ESI和APCI)容易受到樣品基質的影響。試驗中發現，樣品基質對離子化有比較大的抑制作用(氣相色譜和氣質色譜多表現為增強)，不同樣品基質對目標化合物離子化的抑制情況存在顯著差異。為消除樣品基質效應，以空白樣品提取液作為標準溶液的稀釋溶液，可以使標準和樣品溶液具有同樣的離子化條件，從而消除或者大大降低樣品基質效應的不一致影響。

(3)提取和凈化條件的選擇

本方法最后確定的提取過程中，稱取約2.5～5.0g蜂產品樣品(蜂王漿、蜂蜜稱量5.0g±0.2g；凍干粉稱量2.5g±0.2g)于50mL離心管中，分別添加氘代標示物HMMNI-D3、IPZ-OH-D3(100ng/mL)100μL，加入20mL乙酸銨(0.1mol/L)溶液充分渦旋提取1min。再加入20mL乙酸乙酯，經過渦旋、液液萃取，將乙酸乙酯層全部移入雞心旋蒸瓶，重復上述操作，合并三次乙酸乙酯提取液于雞心旋蒸瓶，在40℃以下濃縮近干，除去溶劑。

本方法最后確定的凈化過程中，雞心旋蒸瓶殘渣用1mL四氯化碳和1mL甲酸水溶液(0.1%)溶解，充分渦旋1min。吸取上層水溶液，用微孔過濾膜(0.2μm)過濾，此為試驗溶液。

(4)前處理選擇和討論

蜂王漿樣品含有大量蛋白質的均勻膠體，要從蜂王漿中提取抗生素和目標化合物，必須破壞其膠體狀態。文獻中有的選擇2%三氯乙酸和2%檸檬酸沉淀蛋白，經實驗，沉淀蛋白質時間短，效果理想，但是沉淀后的上清液經乙酸乙酯提取后，由于有酸性溶液存在，乙酸乙酯溶液難濃縮干。還有的實驗而在負離子電離模式下，低濃度的乙酸銨鹽溶液能夠起到參與增強和活化離子化過程作用(比如氯霉素的LC-MS/MS方法下的流動相為2mmol/L的乙酸銨和乙腈混合梯度)。當然，如果梯度選擇不當或者不優化，造成峰形不是很好，峰尖不夠尖銳，甚至保留時間有較大漂移，原因不詳。采用0.1%的甲酸溶液作為流動相，峰形優異，響應較好，也非常穩定。

(2)質譜測定條件的研究

1)質譜測定條件的優化

首先采用1mg/L的目標化合物的標準溶液分別以流動注射的方式在正/負離子模式下分別進行ESI源或者APCI源的母離子全掃描。

大氣壓電離源(atmospheric pressure chemical ionisation，APCI)是由ESI(電噴霧電離源)派生出，用大氣壓下電暈放電產生反應離子，既而再與溶液中樣品分子發生離子分子反應，從而產生樣品的質子化分子([M+H]+)或加合離子。APCI在小分子分析中與ESI相比，是一種溫和的電離方式；目前，國內雖然大部分LC質譜實驗室配備了APCI，但是實際使用和開展的應用非常少。本次實驗中，首先嘗試使用ESI源摸索質譜條件，效果并不理想：總離子流較低，Q1全掃描特征母離子響應不明顯；通過改變方式，將連續推注針閥PEEK管端與HPLC接色譜柱的PEEK管端以三通的連接方式共同導入所使用的APCI源LC入口，進行質譜條件實驗：設定HPLC四元泵以200μL/min左右且適合硝基咪唑化合物液相等度分離的流動相比例運行，同時，配吸有Nitroimidazoles各主要分析物單標(濃度5～10ppm左右均可)的連續推注針閥仍按常規方式以5uL/min的速度工作。由于解決了單標藥物溶液的持續供給(ESI方式不存在這個矛盾)，并通過提供適量且連續流動液，再輔助以150℃左右的霧化加熱，使得APCI電離方式得到極至發揮。

經過試驗確定：在APCI源正離子模式下硝基咪唑類的準分子離子峰響應信號更優越；以硝基咪唑類正離子模式下的準分子離子為母離子，對其子離子進行全掃描，初步選取豐度較強、干擾較小的兩至三對子離子為定性離子。

2)樣品基質效應的消除

電噴霧電離離子源(ESI和APCI)容易受到樣品基質的影響。試驗中發現，樣品基質對離子化有比較大的抑制作用(氣相色譜和氣質色譜多表現為增強)，不同樣品基質對目標化合物離子化的抑制情況存在顯著差異。為消除樣品基質效應，以空白樣品提取液作為標準溶液的稀釋溶液，可以使標準和樣品溶液具有同樣的離子化條件，從而消除或者大大降低樣品基質效應的不一致影響。

(3)提取和凈化條件的選擇

(4)前處理選擇和討論

蜂王漿樣品含有大量蛋白質的均勻膠體，要從蜂王漿中提取抗生素和目標化合物，必須破壞其膠體狀態。文獻中有的選擇2%三氯乙酸和2%檸檬酸沉淀蛋白，經實驗，沉淀蛋白質時間短，效果理想，但是沉淀后的上清液經乙酸乙酯提取后，由于有酸性溶液存在，乙酸乙酯溶液難濃縮干。還有的實驗采用文獻方法，選10%偏磷酸溶液沉淀蛋白質，但是這些處理手段效果都一般。

本實驗前期的工作主要采用稱取約5.0～10g±0.2g左右的蜂產品樣品(包括蜂王漿、蜂蜜、凍干粉等)于250mL錐形瓶中，依次加入多種硝基咪唑類藥物、氘代標示物HMMNI-D3、IPZ-OH-D3后，分別加入18mL、5～10mL、10mL的2mol/L氫氧化鈉溶液、20mmol/L乙酸銨溶液、2mol/L鹽酸溶液。

其中氫氧化鈉溶液和乙酸銨溶液加入后需要及時對樣品進行渦旋、溶解，樣品進一步均勻化后用2mol/L鹽酸進行pH調節。

隨后將充分渦旋的樣品均勻的平分到兩個50mL的塑料離心管中，分別加入15mL乙腈、15mL乙酸乙酯。對樣品進行渦旋、液液萃取。

每個獨立樣品需要收集平分到兩個50mL的塑料離心管中的有機相提取液，旋渦混合儀充分混勻2min，放入高速冷凍離心機離心(時間10min，轉速5000r/min)；吸取有機層；合并到一個雞心旋蒸瓶中；并分別再次加入5mL乙腈、5mL乙酸乙酯；對樣品進行渦旋、液液萃取后合并提取液。合并后的提取液，于旋轉蒸發儀濃縮近干(可能會有2～4mL水相)，再次加入0.2mol/L的鹽酸溶液15mL，充分混勻，備用供SPE柱凈化。

用OASIS MCX C18 SPE柱凈化(先用5mL水、5mL甲醇活化，上樣后分別10mL水、10mL甲醇淋洗)，經10%氨水甲醇溶液5mL洗脫，收集至15mL離心管中，于氮吹儀氮吹揮至近干，加入1mL流動相，充分旋渦混合，經0.22μm濾膜過濾，供HPLC-MS/MS分析。

這一處理過程結果相對較為復雜繁瑣，實驗結果中替硝噠唑和洛硝唑回收率不理想，所以最后選擇了加入20mL的0.1mol/L乙酸銨、乙酸乙酯，液液萃取，濃縮近干，除去溶劑后殘渣用1mL四氯化碳和1mL甲酸水溶液(0.1%)溶解，充分渦旋1min，吸取上層水溶液進樣的方案。

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