苯并咪唑類藥物測定——生物學方法

時間：2023-03-24 23:10:22來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

苯并咪唑類藥物測定——生物學方法

[db:作者] / 2022-12-21 00:00

17.1.4.2 測定方法

BMZs的測定方法主要有生物學方法、免疫檢測法和儀器檢測法。生物學方法和免疫檢測方法快捷、簡便、靈敏，但易產生較高的假陽性率，僅作為篩選方法。儀器檢測法主要是色譜技術與通用檢測器，如紫外檢測器(UVD)、熒光檢測器(FLD)或質譜(MS)聯用，是目前BMZs殘留分析的主要技術手段。其中，MS是歐盟2002/657/EC決議中規(guī)定使用的確證方法，可進行定性、定量檢測。

(1)生物學方法

生物學測定BMZs的方法主要用于日常評估食品中潛在的驅蟲藥。生物學測定通常的做法是，首先在薄層色譜(TLC)平板上分離殘留物，然后在平板上依次噴上營養(yǎng)瓊脂和含有指示生物的溶液，若TLC平板上出現抑制帶，則表明有BMZs殘留，抑制帶的大小與BMZs殘留的濃度相關。Rew等建立了一種用豬蛔蟲幼蟲多孔篩選分析TBZ、ABZ、ABZ-SO、ABZ-SO2和MBZ的方法。不同的藥物和濃度對不同發(fā)育階段(L2～L4)幼蟲的作用不同，L2確定為幼蟲的蟲卵孵化階段，L3為第一次蛻皮，L4為第二次蛻皮。所有藥物殘留物在10ng/mL時能夠抑制L2～L3階段的幼蟲，L3～L4階段的幼蟲也能被BMZs抑制。這種幼蟲抑制與BMZs的類型和濃度高度相關。ABZ、MBZ、TBZ、ABZ-SO和ABZ-SO2的抑制濃度分別為10ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、100ng/mL和1000ng/mL。生物分析方法作為食品中BMZs殘留檢測的篩選方法是較廉價的，但試驗生物對BMZs代謝物或殘留標示物敏感性的變化是關鍵問題，還需要進-一步研究。

(2)免疫分析法(immunoasay，IA)

免疫分析方法簡單、靈敏、選擇性好，常用于測定生物基質中BMZs殘留。在某些情況下，采用免疫學方法分析血漿、血清和牛奶等樣品，可以直接測定或稀釋后測定。目前采用的免疫分析主要有放射免疫分析法、酶聯免疫法和免疫傳感器方法。

1)放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)

RIA早期被用于測定動物組織中BMZs殘留。Nerenberg等建立了測定血漿中OFZ殘留的RIA分析法。在水溶性碳化二亞胺偶聯劑(EDC：HCI)中，將OFZ通過碳化二亞胺反應偶聯到聚賴氨酸載體，免疫兔子，制備多克隆抗體。將緩沖液、標記物、標準品、未知物、抗血清等加入試管中漩渦混合，密封后在水浴40℃下過夜孵化，降溫后進行添加，離心，取上清液轉移至閃爍瓶，加入閃爍液，用閃爍光譜儀進行液體閃爍計數。該方法的LOD為200pg/mL，重復試驗的標準誤差(SD)為5%。

2)酶聯免疫分析法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)

近年來，ELISA逐漸取代了RIA，在BMZs殘留分析中得到了廣泛應用。Brandon等將TBZ和TBZ-5-OH偶聯到牛血清白蛋白(BSA)上制備免疫原，免疫小鼠產生單克隆抗體，建立了測定肝組織中TBZ的競爭性ELISA法。雖然用TBZ-5-OH偶聯物制備的抗體特異性低，但對CAM和TBZ-NH2顯示出很好的交叉反應性能；研究發(fā)現抗體對BMZs的交叉反應性并不在噻唑環(huán)上，所以對ABZ、MBZ和FBZ交叉反應較小。該方法LOD小于20ng/mL，平均回收率為97%，CV為17%。隨后，該作者又用琥珀酰胺連接ABZ到BSA載體蛋白，免疫小鼠，制備出了單克隆抗體，對11種氨基甲酸酯類BMZs顯示出很好的交叉反應性，包括ABZ、FBZ、OXI、MBZ、FLU、MBZ和一些代謝物，但對噻唑類BMZs(TBZ、CAM和TBZ-5-OH)沒有交叉反應。該ELISA方法對ABZ及其代謝物的LOD為58ug/kg。Moran等采用新的免疫原(5-苯并咪唑羧酸)偶聯到脂肽Pam；Cyst-TH制備出鼠單克隆抗體，這種抗體能夠用來建立測定組織中與蛋白結合的TBZ代謝物的ELISA方法，但沒有實際應用的介紹。陳飛等應用競爭ELISA技術，建立了一種快速檢測動物組織中BMZs多殘留的方法，并對其技術性能進行了評價。該方法的半數抑制濃度(IC50)浮動范圍為0.9～1.5μg/L，動物組織樣本的LOD為8μg/kg；樣本添加回收率為79.8%～100.5%，CV為7.2%～9.5%。

3)表面等離子體共振技術(surface plasmon resonance，SPR)

表面等離子共振技術是20世紀90年代發(fā)展起來的一種生物分子檢測技術，是基于SPR檢測生物傳感芯片上配體與受體相互作用的一種傳感器技術，是利用金屬膜/液面界面光的全反射引起的物理光學現象來分析分子相互作用。SPR傳感器與傳統檢測手段比較，具有無標記，實時監(jiān)測，靈敏度高等突出優(yōu)點。所以，在醫(yī)學診斷，生物監(jiān)測，生物技術，藥品研制和食品安全檢測等領域有廣闊的應用前景。

Keegan等建立了牛奶中11種氨基甲酸酯類BMZs殘留的SPR檢測方法。該方法采用多克隆抗體建立，該抗體是由5(6)-羧戍基硫基-2-苯并咪唑氨基甲酸酯蛋白偶聯物制備的。前處理方法采用改進的QuEChERS方法。該方法的LOD為2.7ug/kg，11種藥物的平均回收率為81%～116%。該作者還建立了兩種SPR篩選方法，檢測肝臟組織中11種氨基甲酸酯類BMZs和4種氨基BMZs獸藥殘留。方法基于羊多克隆抗體，樣品用乙腈提取，氨基甲酸酯類BMZs用C18吸附劑凈化，氨基BMZs直接用環(huán)已烷除脂凈化，SPR測定。氨基甲酸酯類BMZs的LOD為32ug/kg，平均回收率為77%～132%；氨基BMZs的LOD為41μg/kg，平均回收率為103%～16%。Johnsson等也將5(6)-羧戊基硫基-2-苯并咪唑氨基甲酸酯蛋白偶聯物制備的多克隆抗體用于SPR分析，測定牛血清中BMZs殘留。該方法顯示對ABZ、FBZ-SO2、MBZ、FBZ和OXI等5種BMZs具有較好的交叉反應性(>74%)。用20個空白血清樣品測定的LOD和LOQ分別為2.6和4.8μg/kg。研究評估了不同樣品處理方法對傳感器響應的影響，發(fā)現用沒有沉淀蛋白的血清制備的標準曲線，同用緩沖溶液制備的標準曲線并不一致。

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